Real-Time qPCR技術

實驗材料：動物組織、動物細胞

試劑或試劑盒：DNA提取試劑盒、RNA酶、瓊脂糖、核酸染料、Loading buffer、DNA Marker、qPCR Mix等。

一、DNA提取，我們選擇 DNA提取試劑盒進行DNA提取。使用前加不同體積100%乙酵到WB2，50 rxns （48 ml）、200 rxns （2x88 ml），所有離心均在室溫下進行。

材料處理（b）加入100 ulLB2和20 ul Proteinase K（確保組織完全進入離心管中）（d） 12000xg離心5分鐘，轉移上清於一無菌的離心管中。3、將全部的溶液加入離心柱中，12000×g離心30s，棄掉流出液。5、重複步驟4一次。7、重複步驟8一次。9、將離心柱放置在一個乾淨的離心管中，在柱中央加入50µl預熱的EB（60℃-70℃），10、為了得到更多的DNA，進行第二次洗脫，在在柱中央加入50µl預熱的EB（60℃-70℃），

靜置1min，12000×g離心1min，洗脫DNA。將洗脫的DNA溶液放在-20℃條件下儲存。

靜置1min，12000×g離心1min，洗脫DNA。

8、12000×g離心2分鐘，徹底去除多餘的WB2。

6、加入500µl溶液WB2（已加入無水乙醇），12000×g離心30s，棄掉流出液。

4、加入500µl溶液CB2，12000×g離心30s，棄掉流出液。

2、加入500µlBB2，立刻渦旋5s，室溫孵育10min。

（c） 55℃孵育直至完全裂解（大約3小時，因組織不同而異，鼠尾大約6-8小時，可以過夜裂解，每小時顛倒2-3次），如果需要去除RNA，可以加入20ulRNA酶於樣品中，室溫孵育2分鐘。

（a）將≤25 mg （脾≤10 mg ）切碎的動物組織置於一無菌的1。5 ml離心管中。

DNA電泳3、 加樣：混合DNA樣品和Loading buffer，用2。5ul微量移液器分別將DNA Marker和樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防汙染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。 5、觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出熒光條帶，採用凝膠成像系統拍照儲存。當DNA樣品中含有蛋白質、酚或其他小分子汙染物時，會影響DNA吸光度的準確測定。一般情況下同時檢測同一樣品的OD260、OD280和OD230，計算其比值來衡量樣品的純度。四、 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR2。 反應如下： β-actin陽性模板的標準梯度稀釋的標準品和管家基因反應體系一樣。

1。 β-actin陽性模板的標準梯度製備：陽性模板的濃度為1011，反應前取3 μl按10倍稀釋（加水27 ul並充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

經驗值：純DNA：OD260 / OD280≈1。8 （＞1。9，表明有RNA汙染；＜1。6，表明有蛋白質、酚等汙染）

三、DNA濃度和純度測定

4、電泳：加樣後的凝膠板立即通電進行電泳，電壓60-100V，樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動，電泳15分鐘左右。

1、 製備1%瓊脂糖凝膠：稱取0。4g瓊脂糖置於錐形瓶中，加入40ml1×TAE，微波爐加熱煮沸至瓊脂糖全部融化，搖勻，稍微冷卻後加入4ul核酸染料，混勻，即成1。0%瓊脂糖凝膠液。 制膠槽放進位制膠板，放好梳子，將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入槽內，使膠液緩慢展開，直到整個表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，將凝膠及內槽放入電泳槽中。新增 1×TAE電泳緩衝液至沒過膠板1-2㎜為止。

反應液的配製

試劑新增量終濃度蒸餾水16μl qPCR Mix25μl1x上游引物（10μM）2μl0。4μM下游引物（10μM）2μl0。4μM樣品溶液5μl Total volume50μl 將qPCR Mix設定為反應體系的1/2，其他的組成成份請參照最適條件進行調整。如需改變反應體系的總體積，其他組成成份也應按相同比例改變。引物的新增量請在終濃度0。2～0。6μM的範圍內進行調整。若擴增效果不理想，增加引物的新增量會有所改善，但新增量過多，則可能會由於非特異性擴增的原因，出現訊號檢出率低的情況。實際配製時，可先將除樣品溶液之外的其他組份預混成n+α倍（n為樣品數，α為分注損耗）的混合液，然後分注到各管（即n管），最後在每管中分別加入相應的樣品溶液。

（2）PCR的迴圈條件

［PCR迴圈（例1）］（三步法，退火溫度60℃／延伸溫度72℃）

95℃60s

↓

PCR迴圈（×40迴圈）： 95℃15s60℃15s72℃45s（data collection）↓

融解曲線分析（Melting Curve Analysis）

［PCR迴圈（例2）］（兩步法，退火／延伸溫度60℃）

95℃60s

↓

PCR迴圈（×40迴圈）： 95℃15s60℃60s（data collection↓

融解曲線分析（Melting Curve Analysis）

五、 製備用於繪製梯度稀釋標準曲線的DNA模板

針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的DNA模板進行PCR反應。

反應體系

序號 反應物 劑量

1 PCR緩衝液 2。5 ul

2 MgCl2 溶液 1。5 ul

3 上游引物F 0。5 ul

4 下游引物R 0。5 ul

5 dNTP混合液 3 ul

6 Taq聚合酶 1 ul

7 DNA 1 ul

8 加水至總體積為 25 ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個PCR迴圈（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72℃延伸5分鐘。

（3）PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

（4）將PCR產物進行10倍梯度稀釋： 將PCR產物進行10倍梯度稀釋： 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

六、 待測樣品的待測基因實時定量PCR

所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。

反應如下：

（1）反應液的配製

試劑新增量終濃度蒸餾水16μl qPCR Mix25μl1x上游引物（10μM）2μl0。4μM下游引物（10μM）2μl0。4μM待測樣品cDNA5μl Total volume50μl 將qPCR Mix設定為反應體系的1/2，其他的組成成份請參照最適條件進行調整。如需改變反應體系的總體積，其他組成成份也應按相同比例改變。引物的新增量請在終濃度0。2～0。6μM的範圍內進行調整。若擴增效果不理想，增加引物的新增量會有所改善，但新增量過多，則可能會由於非特異性擴增的原因，出現訊號檢出率低的情況。實際配製時，可先將除樣品溶液之外的其他組份預混成n+α倍（n為樣品數，α為分注損耗）的混合液，然後分注到各管（即n管），最後在每管中分別加入相應的樣品溶液。

（2）PCR的迴圈條件

［PCR迴圈（例1）］（三步法，退火溫度60℃／延伸溫度72℃）

95℃60s

↓

PCR迴圈（×40迴圈）： 95℃15s60℃15s72℃45s（data collection）↓

融解曲線分析（Melting Curve Analysis）

［PCR迴圈（例2）］（兩步法，退火／延伸溫度60℃）

95℃60s

↓

PCR迴圈（×40迴圈）： 95℃15s60℃60s（data collection↓

融解曲線分析（Melting Curve Analysis）

七、 實時定量PCR使用引物列表

引物設計軟體：Primer Premier 5。0，並遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構；引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應（即錯配）。

八、電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進行Real time PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

文章轉載於北京吉田生物科技有限公司