全基因合成
是指在體外利用人工方法合成雙鏈DNA分子的技術。基因合成無需模板，是獲取基因的重要手段之一。目前該技術主要應用在克隆一些不易獲取模板的基因、自然界不存在的新基因以及異源基因表達上，經常在對基因密碼子最佳化後進行。
全基因合成技術已經很成熟，一般的做法是：設計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，透過重疊延伸PCR法拼接出全長。關於全基因合成方法的資料網上一大堆，單全基因合成的相關專利就有上百篇，常見的有重疊延伸PCR（OE-PCR）法［1，7］，雙不對稱PCR（DA-PCR）法［2］，聚合酶連反應法（PCR）［3］，連線酶鏈反應法（LCR）［4］，熱力學平衡由內向外法（TBIO） ［5］，PCR介導兩步法（PTDS）［6］。方法很多，但它們的共同特點基本相同：基於具有重疊區的引物，透過重疊延伸PCR逐漸延伸生成長片段。
全基因合成最簡單的方法是什麼？
當然是讓DNA合成公司來合成，我們只需要提供DNA序列資訊，他們會合成dsDNA並克隆在通用載體上，一般還提供測序資訊，確保合成的正確性。這無疑是最簡單、最省事的方法。而且現在全基因合成十分廉價，1bp不到一塊錢還帶測序的那種。
既然DNA合成公司那麼方便，為什麼還要自己合成呢？
①公司合成較慢，一般需要1-2周。如果碰到特殊序列，比如對大腸桿菌毒性較大的編碼序列，那週期就難說了（我們做過一個核酸酶，合成公司一個月沒搞定，自己合成一週搞定）。
② 後繼操作麻煩，合成公司提供的一般是攜帶目標基因的重組載體，拿到後還要用酶切切下來，如果基因內部含有酶切位點還需要避開，當然這些一般不是什麼大問題，但你確實沒得選。
③如前所述，全基因合成一般用於異源基因表達，異源表達的物件大多是酶，研究酶的性質可能又需要構建大量突變體。合成公司只提供一個序列，構建突變體還得自己設計引物重新構建，如果自己合成全基因，只需要將包含突變的引物替換掉，就可以同時獲得各類突變體，這在構建含大量突變的突變體時，更有優勢。
④序列需要保密，畢竟自己才最可靠。
總有人喜歡自己動手豐衣足食，
本文要介紹的是自己來合成的方法，
介紹兩種方法：
1 基於“搭橋”PCR的一次性拼接法
這種方法依賴於引物間的相互退火，彼此作為模板相互延伸，因此需要的引物總是一正一反。首先把全基因序列打斷為短的oligos，一般不大於59bp，因為一般引物合成以59bp為分水嶺，超過59bp價格和時間成本都會高很多。oligos靠3‘末端互補序列相互退火，形成帶有gaps的雙鏈產物，再由DNA聚合酶補齊gaps，形成帶有切刻的DNA雙鏈，這種產物經過Taq DNA Ligase連結形成完整的雙鏈產物，依此為模板進行PCR擴增即可得到目標基因，也可以直接使用帶有切刻的DNA雙鏈作為模板進行PCR擴增。
2 基於逐漸延伸的step by step法
這種方法僅最後一條引物為反向，其餘均為正向，正向引物間具有重疊序列。倒數第一條oligo與倒數第二條oligo靠末端互補序列相互退火，經過第一次PCR迴圈，雙鏈延長，延長的雙鏈與倒數第三條oligo繼續退火、延長，……，依此類推，直至全長序列合成。這種方法理論上一次PCR迴圈只能延伸一條引物，N條oliogs就至少需要經過N個PCR迴圈，由於只有一個延伸端，引物設計比方法1簡單，而且引物數目不需要必須為偶數。
全基因合成一般步驟
1.設計PCR引物
可以藉助自動設計工具也可以人工設計，藉助工具後面會詳細介紹。如果人工設計，推薦使用SnapGene（這款軟體的強大就不多說了，搞分子生物學的應該都知道，網上有很多破解版），將全基因序列複製進去之後，先調出“Preferences”面板，找到“Primer”選項，把3’端最短匹配長度和最低Tm分別設定為10bp和40℃，這樣當你新增引物時軟體就會自動提醒有沒有次級結合位點（如下圖）。
因為3’端錯配對本文中的全基因合成方法十分不利，如果這兩個設定太低實在難以設計出引物，可以適當調高至12bp和45℃，還不行的話只能最佳化密碼子後再重新設計。
引物的長度預設為59bp，重點是重疊區的設計，一般應該根據重疊區的Tm來確定，不同重疊區之間的Tm平衡很重要，一般∆Tm不超過3℃，推薦把Tm設定在55-58℃之間。需要注意的是，針對本文的方法一，引物數目必須是偶數，從序列開頭往後一條一條的拉，下一條oligo的起點是上一條的終點-重疊區，上正下反，如果最後為奇數條，要調整最後幾條長度，補出一條反向引物。
針對方法二，從序列開頭拉一條正向，剩餘全部為反向直到末尾，也可以從末尾拉一條反向，剩餘為正向直到開頭，這種方法不用管引物數目。
2.PCR獲得全長產物
一般需要兩輪PCR。第一輪，加入少量引物，推薦50uL體系中0。5-1pmol/個oligo，10-15個迴圈，獲得全長模板，本輪PCR推薦使用的DNA聚合酶應該同時缺失3’-5’和5’-3’外切酶活性，這兩種活性會損傷重疊區的Tm平衡；第二輪，取1uLPCR產物做模板，加入20pmol全長上下游引物，20-25個迴圈獲得目標基因，本輪PCR應使用高保真DNA聚合酶。
3.克隆至表達載體
透過同源重組，酶切連結等方法將目標基因插入載體中，轉化大腸桿菌或其他宿主感受態細胞，獲取單克隆子。提示：在全基因合成前，一定要針對克隆/表達載體設計好同源臂或者酶切位點，直接加在全基因序列上，否則還要單獨設計引物新增同源臂或者酶切位點。
4.測序鑑定
菌體PCR鑑定陽性克隆子並挑選陽性克隆子測序，正確的克隆可用於下游的表達和純化。
線上設計工具
以前有很多優秀的引物設計工具，比如
OPTIMIZER
：
http：//
genomes。urv。es/OPTIMIZE
R/
，集密碼子最佳化和全基因合成於一身，
Gene2oligo
［9］：
http：//
berry。engin。umich。edu/g
ene2oligo
，它設計出的引物之間是沒有空隙（gaps）的，不過該連線好像失效了。其他還有
Assembly PCR Oligo Maker
［10］，
GeMS
［11］，
GeneDesign
［12］，遺憾的是他們的連結可能目前都失效了。
DNA Works
［8］：
https：//
hpcwebapps。cit。nih。gov/
dnaworks/
，這是一個可用的全基因合成引物設計工具，該工具來源於《Nucleic Acids Research》，支援密碼子最佳化等操作，不過引數比較多，使用起來有點複雜。
Gene2oligos
：
http：//www。
biorun。com/tools/104。ht
ml
，這個是伯遠研發人員編寫的線上工具，包括密碼子分析與oligos引物設計，將目標基因自動轉化為oligos引物，用於隨後的全基因合成。生成的oligos，具有統一長度，重疊區具有相同的Tm值，有利於引物間退火平衡，生成的oligos可以一鍵複製，匯入SnapGene進行詳細分析。
引物設計原則
長度：
40-59bp，原則上引物長度即不能太短也不能太長。太短可能重疊區不夠，無法達到Tm均衡，而且oligos之間空隙很短或者沒有空隙，這樣相當於對目標基因全覆蓋，比較耗費鹼基。引物越長，gaps越大，更節省鹼基，但引物越長，引物合成越困難，我在［《》］（）一文中介紹過，引物越長副產物越多，如果沒有高規格的純化方式，可能會導致增高的非特性拼接機率。有些文獻喜歡用40-46nt的引物，本文優先考慮長鹼基，畢竟節儉鹼基嘛。利用本文的方法，一般需要合成的總鹼基數是全長序列的1。5倍，按照普通引物合成的價格，能夠比合成公司節約將近40%的成本。
重疊區：
在oligos相互退火時，引物間的結合是同時發生的，因此重疊區的Tm均衡就十分重要，如果某些oligo的Tm過低，退火時不易與其它oligos結合可能導致缺失，如果Tm過高，可能形成穩定的中間片段，不利於獲得全長模板。
3’端錯配：
針對本文所述的兩種方法，3’端的錯配可能會導致錯誤的產物，比如有1-6條oligo，原本應該按順序連線起來，如果引物1和4末端存在互補序列，那麼就可能形成縮短產物，而且這種產物在第二輪PCR中往往被優先擴增，這會影響下游實驗。當然有時某些引物的3’端可能存在多個結合位點，尤其是高GC的序列，可能不得不存在幾個錯配鹼基。那麼這個3’端錯配長度是多少才能使用呢？當然這個沒有絕對界限，比如按Tm計算比完整重疊區的Tm低20℃，實際上這也是降低了錯配的機率，我在以前的文章中解釋過Tm的意義，Tm為40℃的序列不是說在50℃就完全不退火了，實際上仍然有一部分退火，只不過比例很低。如果使用長度來界定，8-10bp是一個常用的標準。此外，引物3’端對PCR延伸效率也很重要，有研究認為最後一個鹼基最好為G/C，因此這一點也需要考慮。
引物條數：
一般，我們想要儘可能少的使用引物，那麼只能使用盡可能長的引物。至於引物數目是不是必須為偶數，這跟方法有關係，依靠一正一反相互延伸的，理論上需要偶數條，如果最後一條為奇數條，一般需要調整前面的引物長度，再補出一條反向引物。
驗證設計效果
我們的程式輸出的引物格式可以被SnapGene識別，選單欄點選“Primer”工具，點選”Import Primer from a List“選項，選擇從剪貼簿匯入序列。
可以檢視個引物是否完全覆蓋目標序列，引物的“頭尾“是否衝突等等。
以GFP為目標序列測試一下：
①從NCBI上找到GFP的序列，貼上到文字框中，首先分析密碼子偏性。
大腸桿菌的稀有密碼子用紅色標出，可見GFP原生基因中含有很多稀有密碼子，可以先執行密碼子最佳化。
②生成oligos，有兩種方式，預設為方法一，如果引物見相似性高，會提示使用方法二。
點選生成oligos按鈕後，會彈出總鹼基數的統計資訊，然後輸出oliogs序號及序列，同時生成實驗方案按鈕和複製按鈕，一鍵複製後可匯入SanpGene分析。
③SanpGene分析
完全覆蓋了GFP的基因，並且為偶數條引物，引物間的Tm基本一致（由於本程式與SnapGene的Tm演算法不一致，因此在SnapGene上會有一定差異）。
④生成實驗方案
體外全基因合成一般一次不超過1000bp，一次性合成太長會增加出錯的機率，推薦你按800bp分段，一般3個及以內的基因片段可使用伯遠2×BioRun Seamless Cloning Kit一次性連入載體。
參考文獻
［1］ Prodromou，C。 and Pearl，L。 （1992） Recursive PCR： a novel technique for total gene synthesis。 Protein Eng。， 5， 827–829。
［2］ Sandhu，G。S， Aleff，R。A。 and Kline，B。C。 （1992） Dual asymmetric PCR： one-step construction of synthetic genes。 Biotechniques， 12， 14–16。
［3］ Stemmer，W。P。， Crameri，A。， Ha，K。D。， Brennan，T。M。 and Heyneker，H。L。 （1995） Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides。 Gene， 164， 49–53。
［4］ Au，L。C。， Yang，F。Y。， Yang，W。J。， Lo，S。H。 and Kao，C。F。 （1998） Gene synthesis by a LCR-based approach： high-level production of leptin-L54 using synthetic gene in Escherichia coli。 Biochem。 Biophys。 Res。 Commun。， 248， 200–203。
［5］ Gao，X。， Yo，P。， Keith，A。， Ragan，T。J。 and Harris，T。K。 （2003） Thermodynamically balanced inside-out （TBIO） PCR-based gene synthesis： a novel method of primer design for high-fidelity assembly of longer gene sequences。 Nucleic Acids Res。，31， e143。
［6］ Xiong，A。-S。， Yao，Q。-H。， Peng，R。-H。， Li，X。， Fan，H。-Q。， Cheng，Z。-M。 and Li，Y。 （2004） A simple， rapid， high-fidelity and cost-effective PCR-based two-step DNA synthesis method for long gene sequences。 Nucleic Acids Res。， 32， e98。
［7］ Young，L。 and Dong，Q。 （2004） Two-step total gene synthesis method。 Nucleic Acids Res。， 32， e59。
［8］ Hoover，D。M。 and Lubkowski，J。 （2002） DNAWorks： an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis。 Nucleic Acids Res。， 30， e43。
［9］ Rouillard，J。-M。， Lee，W。， Truan，G。， Gao，X。， Zhou，X。 and Gulari，E。（2004） Gene2oligo： oligonucleotide design for in vitro gene synthesis。 Nucleic Acids Res。， 32， W176–W180。
［10］ Rydzanicz，R。， Zhao，X。S。 and Johnson，P。E。 （2005） Assembly PCR oligo maker： a tool for designing oligodeoxynucleotides for constructing long DNA molecules for RNA production。 Nucleic Acids Res。， 33， W521–W525。
［11］ Jayaraj，S。， Reid，R。 and Santi，D。V。 （2005） GeMS： an advanced software package for designing synthetic genes。 Nucleic Acids Res。， 33， 3011–3016。
［12］ Richardson，S。M。， Wheelan，S。J。， Yarrington，R。M。 and Boeke，J。D。 （2006） GeneDesign： rapid， automated design of multikilobase synthetic genes。 Genome Res。， 16， 550–556。
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