撰稿 | 李曉葦
校審 | 尹芝南教授
原文連結：
https：//www。
cell。com/cell/fulltext/
S00928674（20）
30555-9
背景
2020年6月3日由哈佛醫學院發表的一項關於睡眠不足與死亡的研究引起人們的關注。研究人員透過果蠅和小鼠兩種模式生物，進行多種睡眠剝奪實驗，模擬睡眠缺失的狀態，從而研究其對生存的影響。研究發現睡眠不足可透過腸道中活性氧的積累從而導致生物死亡，當口服抗氧化劑化合物或靶向腸道抗氧化酶的表達可以逆轉這一現象。該項研究的最終結論是，嚴重的睡眠不足導致的死亡可能是由氧化應激引起的，腸道的氧化應激反應是主要原因，並且當活性氧（ROS）的積累被阻斷時，可以達到睡眠不足但生存無影響。
01 名詞解釋
1
【睡眠不足】
大量的臨床資料和實驗研究都表明睡眠不足與嚴重的健康問題具有高度相關性。睡眠是一種生物對外界刺激反應速度減慢的生理狀態，對認知功能，免疫功能以及機體的新陳代謝都具有至關重要的作用。人們普遍認為，睡眠是由大腦神經元驅動，當睡眠不足，睡眠調節神經元的氧化還原狀態會實時改變，並且機體會發生一系列生命活動紊亂。
2
【活性氧】
活性氧（reactive oxygen species ， ROS）是體內一類氧的單電子還原產物，，是電子在未能傳遞到末端氧化酶之前漏出呼吸鏈並消耗大約2 %的氧生成的，包括氧的一電子還原產物超氧陰離子（O2·-）、二電子還原產物過氧化氫（H2O2）、三電子還原產物羥基自由基（·OH）以及一氧化氮等。ROS 的產生主要是線粒體由狀態Ⅲ向狀態Ⅳ轉換中高氧的環境和高還原態的呼吸鏈使大量電子漏出並還原氧分子而形成。
3
【GAL4/UAS系統】
（摘自Genetics on the Fly： A Primer on the Drosophila Model System；2015）
果蠅攜帶具有組織特異性啟動子/增強子的“驅動程式”，該程式中具有編碼酵母GAL4轉錄因子的基因（A左）和感興趣的基因位於上游啟用序列（UAS）後面。而這種UAS是由GAL4啟用表達的（A右）。（B）單獨攜帶兩個構建體之一的轉基因果蠅不表達目的基因（綠色），但當兩種構建體果蠅雜交是，組織特異性啟動子驅動GAL4的表達，進而開啟並表達特定組織的靶基因。
02 結果解讀
Fig 1
一、睡眠不足會導致過早死亡
在果蠅中，常見的睡眠剝奪方法依賴於各種神經元的熱刺激，當外界達到一定溫度（29℃），這類神經元被啟用，從而抑制睡眠。前人研究發現，Gal4s能夠促使熱啟用的陽離子通道蛋白TrpA1的表達，從而靶向於這類神經元，達到睡眠剝奪的目的。
作者首先檢測兩種不同“驅動程式”GAL4s的表達（GFP））（Fig1。A-D），並在第一天檢測各種果蠅（黑線代表UAS-TrpA1果蠅；灰線代表11H05-Gal4果蠅；綠線代表能夠表達TrpA1的雜交果蠅）在正常溫度21℃下的睡眠基線，其三者的睡眠量相同。隨後作者在溫度29℃的情況下，對各種果蠅睡眠狀況進行檢測，可以發現，表達TrpA1的果蠅睡眠時間明顯縮短。說明，溫度升高至29℃可達到睡眠剝奪的效果。
將溫度調至29℃時，睡眠不足的動物死亡的時間均早於其睡眠充足的父本母本對照的死亡時間（Fig。1E）。在剝奪睡眠的第10天左右，高死亡率就變得更加明顯了，並且有些果蠅還會因為睡眠剝奪而在早期就死亡（Fig。1E-F）。
研究表明，動物體內具有一種強大的代償機制，動物一段時間睡眠不足會促使機體恢復清醒，進入下一個睡眠-覺醒週期。於是作者在第10天停止剝奪睡眠行為，結果顯示存活的動物能建立正常的睡眠-覺醒週期，並且其壽命與對照組一樣長（Fig。1G）。這表明睡眠剝奪至少在某種程度上是可逆的。
為了弄清睡眠剝奪對果蠅的影響持續了多長時間，作者對果蠅進行10天睡眠剝奪，接下來讓不同果蠅任意睡眠不同的時間，然後再次剝奪其睡眠。結果顯示，睡眠剝奪10天后，果蠅“補眠”5天或10天並不能消除第一次剝奪的影響（Fig。1H，前兩幅圖）。然而，將果蠅“補眠”時間延長到15天，果蠅似乎完全恢復了，基本在20天后才全部死亡（Fig。1H，最後一張圖）。這些結果表明，睡眠喪失期間損害的逐漸積累，在恢復睡眠期間也逐漸得到修復。
Figure 1。 Sleep Deprivation Shortens Lifespan
Fig 2
二、睡眠不足會導致過早死亡
由於死亡率在睡眠剝奪的第10天左右增加（Fig。1E-F、Fig。2A），因此作者檢測了前幾天整個果蠅各種細胞損傷的標誌物。除腸道內ROS水平升高外，大多數睡眠剝奪動物和非剝奪動物的組織其他指標幾乎沒有區別（ Fig。2B-C）。高ROS水平主要在中腸中觀察到，該腸跨越大部分腸道長度，但邊界清晰（Fig。2D）。由於高反應性，ROS極其不穩定，因此很難檢測。但當探針被ROS氧化時形成穩定的熒光產物，再去檢測熒光產物，便可間接檢測ROS的水平。二氫乙錠（DHE）被認為是此類探針中最靈敏，最特異的，可用於檢測活（非固定）組織中的超氧自由基。DHE是一種細胞膜滲透性的藍色探針一旦與超氧化物反應，生成2-羥基乙錠，它會嵌入DNA併發出紅色熒光。超氧化物是ROS的前體，因此DHE熒光越紅，則ROS水平越高。
Figure 2。 ROS Accumulate in the Fly Gut upon Prolonged Thermogenetic Sleep Deprivation
結果顯示，ROS的積累是逐漸的，並在睡眠剝奪的第10天達到峰值（Fig。2E，頂行、Fig。2F）。停止睡眠剝奪後，ROS水平逐漸降低（Fig。2E，底行、Fig。2F），在15天后接近基線（Fig。2F）。結合上述結果，作者得出的結論是，剝奪睡眠是腸道中ROS升高的最可能原因。
Fig 3
三、其他睡眠剝奪方法同樣導致腸道中ROS的積累
為得到確切的結論，作者使用了其他方法來剝奪睡眠。機械振動已用於果蠅的急性短期睡眠剝奪。使果蠅暴露于振動確實會導致睡眠減少，但個體之間（Fig。3A、D ）以及日間（Fig。3B）的異質性很大。大多數果蠅在第一天就表現出明顯的睡眠障礙，但隨後睡眠增加（Fig。3A）。少數果蠅睡眠障礙長達一個星期（Fig。3A）。這種異質性可能是由於習慣或機械性剝奪所引起的代償性睡眠（“補眠”）驅動增加。為了解答這一疑惑，作者在停止振動後立即觀察果蠅睡眠狀態，結果發現，跟猜想一致，作者觀察到果蠅的反彈睡眠（Fig。3C）。
接下來應驗證睡眠剝奪導致壽命縮短這一結論，但作者認為，機械振動這種剝奪睡眠的方式經常致使果蠅損壞腿或翅膀，最終難以將觀察到的壽命縮短與睡眠剝奪聯絡起來。儘管有這樣侷限，但作者仍探討了機械振動引起的睡眠不足是否會導致ROS積累這一問題。因為這些果蠅皆經歷了同樣的睡眠剝奪處理，儘管睡眠量不同，但仍然可以直接比較以揭示睡眠喪失對ROS水平的影響。與熱源性剝奪睡眠一致，ROS在腸道中累積並且僅在經歷持續睡眠喪失的動物中累積（Fig。3E）。這支援了睡眠剝奪本身會引起ROS積累的觀點。
Figure 3。 Other Methods of Sleep Suppression Also Lead to ROS Accumulation in the Gut。
上述兩種睡眠剝奪的物理方法，都表明睡眠剝奪本身就會引起腸道ROS的累積，為了進一步正確該結論的確切性，作者採用RNAi或突變的方法使睡眠調節相關基因沉默或功能喪失：Cyclin A（CycA），Insomniac（Inc），Redeye（Rye），和Sleepless（SSS）。結果如預期，靶向突變或利用神經元RNAi作用於Cyclin A （elav> CycA RNAi）或突變redeye（rye T227M）（Fig。3H）， Sleepless（SSS Δ40）（Fig。3J），和 Insomniac（inc 2）（Fig。3L），結果顯示靶向基因沉默或功能喪失，確實可以減少睡眠（Fig。3F）。
與其他兩種剝奪方法一致，這些被長期剝奪睡眠的果蠅腸道中ROS水平升高（Fig。3G，3I，3K、3M），結合上述結果，表明睡眠不足確實會導致ROS積累。
Fig 4
四、睡眠剝奪引起的氧化應激導致腸道細胞受損或死亡
ROS可以透過氧化造成 DNA 損傷從而破壞細胞大分子。為檢驗睡眠不足的果蠅腸道是否發生細胞破壞，作者透過組蛋白H2A磷酸化染色、應激顆粒以及溶酶體的數量來反映損傷程度。組蛋白H2A磷酸化水平越高，DNA損傷越嚴重。氧化應激程度越高，應急顆粒（RNA蛋白質聚集物阻止翻譯並保護mRNA）以及溶酶體（降解受損細胞成分的細胞器）的數量也會越多。結果顯示，睡眠不足的果蠅腸道細胞損傷嚴重（ Fig。4A-B ） 。
持續的氧化最終會導致細胞死亡，而作者在整個腸道中觀察到凋亡和壞死的標誌物（ Fig。4A-B ）。儘管這些細胞損傷現象皆符合氧化應激的概念，但ROS到底是損傷的誘因，還是結果，目前仍無定論。因為所有氧化應激標誌物僅在ROS開始積累後才出現（ Fig。4C-D），因此作者認為ROS可能位於細胞死亡觸發訊號的下游，即細胞損傷和細胞死亡是 ROS 增加的結果而不是原因。
Figure 4。 Sleep Deprivation Causes Oxidative Stress in the Gut
Fig 5
五、睡眠剝奪導致哺乳動物腸道內的ROS積累和氧化應激
為了進一步確認在果蠅這一模式生物得到的結論：睡眠剝奪導致腸道ROS積累即氧化應激反應，作者採用哺乳動物C57BL/6J小鼠進行睡眠剝奪模型構建。透過輕柔但持續的機械刺激，即將小鼠放入Pinnacle Technology剝奪裝置中飼養，其中有一根緩慢旋轉的棒使小鼠頻繁移動，從而剝奪小鼠5天的睡眠（Fig。5）。接下來，作者透過腦電圖（EEG）/肌電圖（EMG）確定睡眠剝奪模型構建成功（Fig。5A）。
Figure 5。 ROS Accumulate in the Mouse Gut upon Sleep Deprivation
接下來，作者對小鼠的內臟器官進行切片染色，用DHE染色檢測ROS水平。結果顯示（Fig。5B-C），與未進行睡眠剝奪的對照組相比，睡眠剝奪的動物在小腸和大腸中的ROS水平升高。睡眠剝奪2天后，小腸的增加很明顯，而大腸的增加則不太明顯，這可能因為ROS本底水平較高。而其他臟器，即使在5天后， ROS水平也沒有明顯變化。免疫熒光染色結果發現，睡眠剝奪2天后，並未觀察到DNA損傷、應激顆粒和細胞死亡的發生，但剝奪睡眠5天后在小腸和大腸中均能清楚地檢測到這些標誌物（Fig。5D）。這些結果再次表明ROS是誘因而不是結果。
Fig 6
六、挽救實驗：中和ROS水平可延長睡眠不足動物的生存期
作者以上所有結果揭示了，睡眠剝奪、ROS積累和過早死亡之間具有高度相關性。為了進一步驗證結論，作者透過清除睡眠剝奪後產生的ROS，進行挽救實驗，探究能否延長生物的生存期。
作者檢測了53種已知的具有抗氧化特性的化合物，確定了11種化合物能夠使果蠅的壽命正常或接近正常（Fig。6A-B）。這些其中包括增加內源性抗氧化酶表達、或者直接中和ROS（Fig。6C-D），最終達到清除ROS的目的。當清除睡眠剝奪動物體內的ROS後，作者進一步檢測動物的生存時間（Fig。6B）。結果顯示，在睡眠剝奪的條件下，清除了果蠅體內ROS後，能夠有效延長果蠅的生存期。
總之，這些結果在睡眠剝奪引起的氧化應激與死亡率之間有著直接的聯絡，且中和ROS水平可延長睡眠剝奪後果蠅的生存期。
Figure 6。 Clearance of ROS Prevents Death of Thermogenetically Sleep-Deprived Flies
Fig 7
七、腸靶向的抗氧化酶表達可防止氧化損傷並延長睡眠不足動物的生存期
透過結果六中的資料，我們不難得出抗氧化物（中和ROS）可使睡眠不足動物壽命延長。但儘管食物攝入的化合物很容易到達腸道細胞，仍舊不能排除這些化合物可以到達其他臟器從而起到間接的保護作用。為了排除這一可能性，作者設計了兩個單獨的轉基因表達系統（LexA / LexAop系統以及GAL4/UAS系統），一個用於熱睡眠剝奪，另一個在腸道中用於酶表達，並在腸道組織中特異性表達抗氧化酶。
50A07和68A07-LexA能夠持續有效的構建熱睡眠剝奪模型（Fig。7A-B）。而腸靶向的抗氧化酶表達則依賴於GAL4/UAS系統（Fig。7C）。使用mexl-Gal4（該驅動程式在中樞神經系統中無表達，見Fig。7C）靶向超氧化物歧化酶1或2（SOD1或SOD2）、或過氧化氫酶（CAT），誘導腸靶向過度表達，清除ROS，從而逆轉了果蠅由於睡眠剝奪而導致的壽命變短的結果（Fig。7D）。
透過mex1或myo1A-Gal4驅動的抗氧化酶（SOD1或SOD2）的過表達，腸道中的ROS水平降低至基線甚至更低（CAT過表達）（Fig。7 E），與此同時，DNA損傷以及細胞凋亡情況也檢測不到（Fig。7 E）。這些結果都直接表明ROS是睡眠不足果蠅腸道中細胞受損的原因。
Figure 7。 Overexpression of Antioxidant Enzymes in the Gut Prevents Death of Thermogenetically Sleep-Deprived Flies
作者透過以上的挽救實驗進一步證實了結論：腸道是嚴重睡眠喪失期間致命性ROS的主要來源（Fig。7F）。
總結
本項研究運用睡眠剝奪的方法，導致果蠅腸道內ROS的積累，觸發腸道一系列的氧化應激反應，並且ROS水平與果蠅的壽命呈現負相關。當口服抗氧化化合物或抗氧化酶的腸道靶向表達，能夠特異性清除腸道中的ROS，從而使果蠅在睡眠剝奪情況下，壽命依然不會縮短。在哺乳動物小鼠睡眠剝奪的情況下，也產生了類似的結果。
03 創新點
1.
闡明睡眠不足導致壽命縮短促進死亡的生物機理，即透過腸道ROS的積累，誘發氧化應激反應。
2.
透過口服抗氧化化合物或抗氧化酶的腸道靶向表達，能夠逆轉這一現象，這為實現臨床轉化提供了方向。
04 拓展性研究
1.
睡眠不足與腸道ROS的因果關係提示腦腸軸之間的超強連線性，但睡眠不足到底是如何調控腸道ROS水平可做進一步探討；
2.
本項研究從果蠅以及小鼠水平闡明瞭生物機理，接下來，可以收集長期睡眠不足等臨床樣本，檢測ROS相關指標，從而更加印證結論；
3.
口服抗氧化物的應用具有一定的現實意義，可從小鼠水平進行挽救實驗，進一步驗證，最終達到臨床使用的目的。
- END -
尹芝南教授
暨南大學生物醫學轉化研究院院長，暨南大學附屬珠海市人民醫院學術總監。
1984年7月畢業於湖北醫科大學醫療係獲學士學位。
1988年8月畢業於上海第二醫科大學上海市免疫學研究所。獲免疫學碩士。
1997年12月畢業於德國柏林自由大學免疫學專業，獲博士學位。
1997-2006年曆任美國耶魯大學醫學院內科系風溼科博士後、助理研究員、助理教授、副教授和訪問副教授。
2007年3月應聘為南開大學生命科學學院院長、博導、長江學者特聘教授、國家傑出青年基金獲得者、973專案首席科學家、天津市生物醫藥創業領軍人才。
2013年7月加盟暨南大學，組建了生物醫學轉化研究院。
長期從事基礎免疫學研究，以通訊作者或第一作者身份在Nature、Journal of Experimental Medicine、Hepatology等權威期刊發表學術論文六十餘篇。是gd T細胞的抗腫瘤免疫功能的發現者之一，並將研究成果成功應用於抗腫瘤免疫的臨床試驗。
