實驗原理
實時熒光定量PCR技術（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是指在PCR反應體系中加入可與DNA產物特異性結合的熒光基團，利用熒光訊號積累實時監測整個PCR程序，最終透過相對定量或絕對定量的方法確定各個樣本的本底表達量。qPCR所使用的熒光化學試劑可分為兩種：熒光染料和熒光探針。
熒光染料SYBR Green：嵌入到雙鏈DNA分子後構象發生變化，能夠吸收497nm的激發光併發出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會發射任何熒光訊號，從而保證熒光訊號的增加與PCR產物的增加完全同步。
SYBR Green 熒光染料法qPCR檢測原理圖
TaqMan 熒光探針：擴增時加入一個特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq 酶的 5‘-3’ 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光訊號，實現了熒光訊號的累積與PCR產物形成完全同步。
TaqMan 熒光探針法qPCR 檢測原理圖
SYBR GREEN 法和 TaqMan 探針法的區別
方法
優點
缺點
應用
SYBR GREEN 法
方便快捷，不必針對各個基因設計合成TaqMan探針，具有價格優勢。
無模板特異性，對引物特異性要求較高，需進行熔解曲線分析；靈敏度相對較低。
應用於基因的差異表達分析，比如RNA干擾效果確認。
TaqMan 探針法
熒光化合物標記到特異性的寡核苷酸上，具有高度特異性，重複性好，熒光訊號強。
只適合一個特定的目標，探針價格較高。
通常應用於基因複製數的確定，在臨床診斷中最常用，比如病毒和病原菌定量檢測。
技術應用
定量方法
原理
技術應用
絕對定量（Absolute Quantification，AQ）
是測定目的基因在樣本中的分子數目，即通常所說的複製數。
病原體檢測；轉基因食品檢測；基因表達研究。
相對定量（Relative Quantification，RQ）
測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的複製數。
基因在不同組織中的表達差異；藥物療效考核；耐藥性研究。
擴增曲線和溶解曲線的常見術語：
常見問題FAQ
Q：qPCR與普通PCR的區別是什麼？
名稱
特點
普通PCR
在PCR反應結束後對終點產物進行電泳定量分析，誤差較大。
qPCR
實時檢測PCR擴增過程，在擴增的指數期對起始模板量進行定量分析，重複性好，誤差小。
Q：請問進行相對定量檢測前提供組織樣本時需要將組織塊定量嗎？
A：
不需要，採用qPCR相對定量法主要是以表達量穩定的內參基因作為對照從而判斷目的基因相對錶達丰度。我們在實驗操作中會對各個環節進行把控，確保實驗結果的客觀性：1）組織抽提的RNA會進行定量；2）正式上機前對樣本進行RT-PCR檢測確定反應條件；3）上機檢測後的相對定量資料分析，計算每個樣本目的基因對相對穩定的內參基因的表達差異，可以排除上樣量的差別對資料分析的影響。
Q：可以進行miRNA的熒光定量PCR檢測服務嗎？與編碼基因的qPCR操作流程上有何區別？
A：
可以，採用專用的miRNA熒光定量PCR試劑盒即可。與編碼基因的qPCR檢測流程上的主要區別是需要將提取後的RNA，用poly（A） 聚合酶在其3’末端加尾，再用5’端帶40nt延伸序列的單鹼基錨定Oligo-dT引物進行反轉錄，得到約80nt的cDNA，然後用特異引物進行SYBR Green實時定量PCR擴增。其中miRNA的引物設計需要大量摸索，才能獲得重複性高可信度高的資料。
Q：如何製備絕對定量 PCR 的標準品？
A：
將欲定量基因的一小段序列（200-300bp）克隆到T載體上，經測序驗證後，進行小量抽提，採用分光光度計定量，按照公式計算複製數後梯度稀釋，用於上機繪製標準曲線，從而計算待檢測基因的複製數多少。
Q：熒光定量PCR有哪些注意要點？
A：
熒光定量PCR的關鍵步驟在於RNA的抽提和引物的設計。RNA的抽提需要嚴格進行RNase
free的操作，抽提的RNAOD260/OD280需嚴格控制在1。9-2。1之間。引物設計主要的考慮是其PCR反應特異性好和擴增效率高，進行PCR反應時無非特異性的條帶和引物聚合體出現，儘量選取GC含量在40-60%的區段進行擴增。另外，還需要適應熒光定量PCR儀上機條件的設定，退火溫度在55-65° C之間。除此之外，其他各個環節如試劑的穩定性，RNA反轉的質量好壞，PCR上機條件的設定，加樣的手法和熟練度等等也要注意。
Q：熒光定量PCR引物的設計原則是什麼？
A：
1）擴增產物長度在80-200bp；引物應在核酸序列保守區內設計並有特異性；引物通常設計為跨內含子。
2）產物不能形成二級結構；引物長度在18-30bp之間，其中鹼基應隨機分佈；待擴增的片段Tm值應在55-65°C之間；待擴增的片段GC含量在40-60%之間；引物自身及引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
3）引物5′端可進行修飾，3′端不能進行修飾； 引物3′端要避開密碼子的第3位。
Q：如何設計熒光定量PCR的TaqMan探針？
A：
TaqMan探針的設計原則為儘量靠近上游引物；長度一般為30-45bp，Tm 值至少比擴增引物高 5° C；5′端不能為 G，因為 G 會淬滅熒光，從而影響定量；設計時，需要透過軟體來進行設計，網路上有許多免費的以及線上的設計軟體可以使用。
Q：可否設計羊源、豬源等其他物種基因的qPCR引物？
A：
可以設計，但對於人，大鼠，小鼠常規模式生物以外的基因（由於無法在NCBI獲得完整的基因序列資訊），在進行PCR最佳化的時候難度遠遠大於常規生物基因，週期會增加，且可能需設計多對引物才可能獲得滿意的實驗結果。
Q：判斷擴增曲線是否良好的指標有哪些？
A：
1）曲線拐點清楚，特別是低濃度樣本指數期明顯。
2）曲線指數期斜率與擴增率成正比，斜率越大擴增效率越高。
3）標準的基線平直或者略微下降，無明顯的上揚趨勢。
4）各管的擴增曲線平行性好，表明各反應管的擴增效率相近。
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