Old story: from Hill equation to MWC model

序：在之前的一篇閒話裡面（知乎專欄）我提到了Hill方程，這是生化領域一個應用廣泛的方程。Hill方程一開始是一個描述血紅蛋白氧結合曲線的經驗定律，後來隨著對血紅蛋白分子研究的深入Hill方程被更加符合物理實際的模型所取代，但是Hill方程因為其簡潔性而仍然被廣泛用於各種實驗研究中，Hill係數更是被廣泛應用作為反應協作性的因子。作為對相關歷史的回顧，以及考慮到相關思想有一定的啟發作用，以下對Hill方程的來龍去脈稍作簡單介紹。

在生物化學仍處於黏糊糊的實驗化學的階段，大家都不知道生物的組成是什麼，所以大家就拿自己手邊可以得到的材料，比如說肝臟，然後磨啊磨啊，磨出一堆黏糊糊的東西，然後用各種可能的手段讓得到的東西分離，然後就拿著這些東西去試試看能不能跟其它東西反應……嗯，要說old story，的確就是這個樣子。在生物化學的各種方法建立起來之前，要對生物體做一番研究，不但需要大量其它領域的知識，還需要過人的洞察力（滑稽）。

在此我們要談到的Hill方程，就是以一位生物化學領域的先驅命名。此人全名Archibald Vivian Hill，是一位英國生理學家，本科時曾在劍橋著名的數學tripos考試中表現優異，後轉向生理學研究。他和德國的Meyerhof OF因為對肌肉生理學的研究分享了1922年的諾貝爾醫學獎。而Hill方程則可以追溯到Hill在1910年發表的關於血紅蛋白氧結合曲線的一篇文章［1］。

在此之前，已經有許多人對血紅蛋白的氧結合曲線作了研究。雖然現在我們知道血紅蛋白主要以含鐵的蛋白四聚體的形式存在，但是那個時候不要說四聚體，連蛋白質是什麼都不清楚，只知道血紅蛋白是一個分子量約為16660的單體分子。但是在氧結合曲線的研究中發現，使用血紅蛋白單體-氧氣結合模型無法很好地擬合方程。所以Hill假定血紅蛋白的氧合行為是和血紅蛋白更高階的聚合物有關。也就是說，單體血紅蛋白Hb在溶液中可以聚集形成多體的血紅蛋白Hbn，而多體的血紅蛋白Hbn具有和單體血紅蛋白Hb不同的結合性質。以後我們會看到，這其實是一個相當超前於時代的思想。為了方便，Hill先討論了只有二階的情況：

其中lambda%為Hb2的分數，K‘和K分別是兩個反應的平衡常數。這個方程已經可以較好地擬合前人的實驗結果（如Barcroft & Camis［1］）。但是Hill並不滿足於此。他認為血紅蛋白既然可以聚集形成二聚體，或許可以聚集產生更高階的聚集體。然而隨著階數提高，擬合方程的計算量也呈爆炸式增加。所以Hill開始思考這個過程中是否存在更加簡單的數學關係。他寫出了一個新的方程，也就是大家所熟知的Hill方程：

在這個式子中，用一個取值為正實數的階數n取代了原本n元結合反應的整數階數，並不對反應的階數加以區分。令人驚訝的是這個方程也能給出對資料的良好的擬合［1］。Hill個人的評價是，雖然這個方程沒有明顯的物理意義，但它卻具有更加簡單的形式。Hill方程可以寫成一個跟上式稍有不同的形式，也就是所謂的Hill Plot。Hill Plot的斜率也就是Hill Coefficient。

（3）式使用的記號跟（1-2）式有不同，這是後來較為常用的一些記法。Y槓是結合的比例，可以類比於langmuir吸附方程裡的theta記號。［X］是氧分子（或其他配體）的濃度，Kd是解離係數。稍微考慮一下我們會發現Hill方程（2）和（1）是不等價的，所以Hill係數並不是一個常數，也就是說Hill Plot並不是一條直線。隨著更多更精確的實驗資料的出現，這一點也變得更加明確。

在這裡我們有必要回想更多關於血紅蛋白研究的歷史。事實上很多年來科學家一直在尋找血紅蛋白氧合曲線的“標準模型”，就連Linus Pauling也在裡面摻了一腿。這一問題在血紅蛋白結構解析以至別構效應的WMC模型提出之後才得到令人滿意的解決。此外早在1904年，Christian Bohr（Niels Bohr他爹）就發現了Bohr效應，也即是血紅蛋白的氧合能力是和pH值相關的，這後來成為血紅蛋白研究的另一個重要論題，當然這事實上只是血紅蛋白氧合機制的不同側面。有機會我們也許會對此作更多探討，不過感興趣的讀者也可以閱讀一些相關的材料。

在20年代，Gilbert S。 Adair發表了他關於血紅蛋白氧合模型的一篇文章［2］。在文中他指出血紅蛋白全複合體的分子量是66700，也就是主要以四聚體的形式存在，所以血紅蛋白的氧合曲線應該可以寫成類似（1）的四階形式。這在後來被稱作Adair方程，這是一系列相關的方程（包括Klotz， Pauling， Koshland-Némethy-Filmer等）的模板。某種意義上我們可以把Hill方程看做是Adair方程的一種近似。但是反過來，如果把Hill係數看做一個變數，那麼Hill係數就是作為不同氧合階段的“協作性”的一種度量。這樣Hill係數就具有了超出了本義的含義，在半飽和狀態下的Hill係數則也許可以稱為“正統”Hill係數，這對應的也是“協作性”的最大值。

血紅蛋白氧合模型的集大成者是Jeffries Wyman，也就是WMC模型的提出者之一。在1964年發表的一篇文章是血紅蛋白研究的經典之作［3］。在這篇文章中他使用統計物理模型推匯出和質量作用原理（law of mass action）推匯出的一樣的結論，並指出質量作用原理是統計物理模型的一個側面。他給出了Hill Plot和結合能的關係，也就是曲線相對下圖成45°角軸的投影。從這個圖中我們可以看出Hill Plot在兩端斜率都趨於1，但是在無限遠處（相當於蛋白質無限飽和和無限不飽和）處漸進與結合能的極大和極小值，這也是可以從模型中得到的直觀資訊。

根據對血紅蛋白作用機制的進一步瞭解，Wyman， Monod， Changeux合作發表了文章［4］，探討了別構效應（allosteric transition）機制。所謂的別構效應，指的是在配體的誘導下分子構象發生轉變，從而改變分子與配體親和力的現象。在血紅蛋白的情形中，四聚體本身由兩對二聚體構成，而二聚體在結合一個配體（氧分子）的狀態下會被別構效應啟用，從而可以更高效地結合氧分子。血紅蛋白與質子的別構效應也正是Bohr效應的原理所在，所以別構效應隱含了血紅蛋白氧合曲線的“標準模型”的道理，或者說氧結合曲線和Bohr效應就是別構效應的不同側面。

WMC模型假定了兩種分子狀態的存在，一種是基本狀態，記為T（tense），一種是被啟用的狀態，記為R（relaxed）。兩個狀態之間具有化學平衡，平衡常數以L表示。T和R結合配體的能力由常數c=Kd（R）/Kd（T）表示。WMC方程式跟Hill方程具有不同的形式。它的缺點在於假設了“別構效應”的框架，而Hill方程對於更大範圍的協作性具有更高的適應性。WMC模型具有下面的形式（其中

表示［X］除以Kd（R）的值）。下式除了飽和度Y bar以外，還包括一個稱為狀態函式的R bar。R bar 表示的是 R 狀態佔總狀態的比例，或者可以是說啟用態的飽和度。在Mirny {5］ 的文章中還給出了WMC模型跟Hill方程的關係，在這種理解下Hill方程式WMC模型的一種近似（以後補充）。

References：

［1］ Hill AV， J。 Physiol。 1910， 40： （Suppl）： iv-vii。

［2］ Adair GS， J。 Biol。 Chem。 1925 63： 529-545。

［3］ Wyman J， Advan。 Protein Chem。 1964， 19， 223。

［4］ Monod J et al， J Mol Biol。 1965， 12：88-118。

［5］ Mirny L， Proc Natl Acad Sci U S A。 2010 Dec 28；107（52）：22534-9。