實驗前的準備
用超淨臺，用之前開紫外照射，把RNAase free水，需要管，大中小槍頭，鑷子，和板子。
放入超淨臺，不吹風，用鑷子裝槍頭，擺EP管。
3大步：裂解Trizol 萃取CHCL3 （氯仿） 沉澱異丙醇
第一步 RNA的提取
從液氮中取出組織後，快速的拿到超淨臺上，放入小皿中，加入trizol試劑，（100mg的組織放入1。2ml的trizol試劑），用注射器進行研磨，注意要熟練，快速研磨。（下面加的試劑按照1ml trizol的比例新增即可）。
細胞或組織加入Trizol研磨後，15~30℃孵育15min，使其充分裂解。（此時如果不接著做下面的實驗可以凍存於-80℃低溫冰箱）。
4℃，12000轉，離心5min ，棄沉澱。（超淨臺準備好EP管，離心後，吸取上清至準備好的EP管中）按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，劇烈振盪15s，（用手震盪即可）15~30℃孵育2~3min。注：禁用漩渦振盪器，以免基因組DNA斷裂。（氯仿又叫三氯甲烷chloroform，一般儲存在4℃冰箱中）。
4℃，12000轉，離心15min。吸取上層水相，至另一離心管中。注：（1）吸取水相要小心，千萬不要吸取中間介面。可採用小槍頭少量多次吸取（2）若同時提取DNA和蛋白質，則儲存下層有機相，存於4℃冰箱內備用，否則棄下層有機相。
按500ul異丙醇/ml Trizol 的比例加入異丙醇，用手震盪一下，15~30℃（室溫即可）孵育10min。2~8℃，12000g，離心10min，棄上清，RNA沉於管底。按1ml 75％乙醇／ml Trizol加入75％乙醇，漩渦混勻，懸浮沉澱。（注：75％乙醇用DEPC水配製）
4℃，7500轉離心5min，儘量棄盡上清（注：用完離心機關電源後，將離心機蓋開啟30分鐘降溫，再蓋上）室溫晾乾或真空乾燥5~10min。（注：不能用離心的方法使RNA乾燥，RNA樣品不要過於乾燥，否則很難溶解。）
1×RNAsafe30 ul（或1‰DEPC水30ul）溶解RNA沉澱，60℃水浴20min（
注：
用蒸餾水配置1/100的DEPC水高壓後才能用，20×RNAsafe 用DEPC水稀釋）測OD值定量RNA濃度（用DU800紫外光度計測量）如果提取的RNA不進行逆轉錄可在-80℃儲存
第二步 RT-PCR操作步驟
一、RNA逆轉錄cDNA（反應體系要20ul）依次加入
1、Oligo（dT）加入1ul。
2、RNA（體積即上一步驟計算出來的）
3、剩下的用無Rnase水補齊共12ul 65℃水浴5min。
二、加入逆轉錄試劑
1、5×Reaction Buffer 4ul
2、Ribolock RNase Inhibiter 1ul
3、10mM Dntp mix 2ul
4、RevertAid m-mul URT 1ul
三、設定儀器，按照說明書設定
1、oligodT：42℃ 60min
2、逆轉錄：70℃ 5min
3、終止：4℃
附加：cDNA可以跑電泳看一下，取cDNA 1ul加load buffer（看這個是幾乘的）混勻，跑電泳，marker用2000的取6ul左右膠板的製作，後面有說明。
四、PCR cDNA擴增目的基因（反應體系是20ul，不夠用無菌水補齊）
下面的實驗用高壓過的槍頭和普通高壓過的水即可。（所用以下配比物品都要在冰箱中凍存，使用之前離心，甩下來即可。量大的話可以先加樣配比，即把所需要的試劑總量計算出後，取出放在ep管中。）
1、加樣：①Mix 10ul ②引物 1ul ③cDNA和水總計9ul
2、混勻：小離心機甩一下即可
3、放入PCR儀：PCR儀事先設定條件，反應條件根據mix說明書來設定
4、PCR產物儲存：一般在4℃冰箱儲存，長時間不用可-20℃凍存。
五、配膠和跑膠：
1、配膠： （水平膠；瓊脂糖凝膠）要帶手套，TAE有毒。
小膠板8孔的 TAE 25ml 瓊脂糖 0。25～0。30g
中膠板25孔的 TAE 50ml 瓊脂糖 0。50～0。55g
步驟：稱取BIOWEST AGAROSE（瓊脂糖）放入配膠專用燒瓶→用配膠專用量筒量1×TAE倒入燒瓶→酒精燈加熱（以看到冒泡為準）→將沸騰的液體轉移到EB汙染區的燒瓶中→加入EB或EB替代（觀察顏色不是很深即可，一般小膠板3滴左右）→插梳子→倒入電泳槽（倒膠從一個角倒入防止產生氣泡）→待膠凝固30分鐘左右拔出梳子進行跑膠（如不馬上跑將膠放4℃冰箱儲存，防止膠變幹）。
2、跑膠：
（1）電泳緩衝液用1×TAE，一般跑5-8次膠後就要重新換電泳緩衝液。
（2）要讓緩衝液沒過膠。
（3）Marker標記染色體上一個可以被識別的區域，我們用的是2000的（儲存在4℃冰箱中）：3-6ul單格加入。
步驟：取PCR產物（cDNA）8ul，加入單格上，接通電源，跑膠。（注意：跑膠方向是從負極到正極），當loading Buffer跑到2/3時停止跑膠（大約40分鐘），帶手套取膠放在照相臺上。
六、照相
注意事項
1、組織或細胞量過少，可酌情減少Trizol 用量
2、組織或細胞量過多，會引起DNA對RNA的汙染
3、高蛋白、高脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿後須2-8℃，12000g離心5min去除不溶物，再進行下面操作，若上層有脂肪物，則也須去除。
4、熱天提RNA，戴手套是必須的，手是Rnase的主要來源。
5、勻漿時，組織塊不宜過大，先用組織剪將組織剪碎，然後再充分勻漿。
6、對實驗器具進行處理。主要有以下幾點，（1） 研磨過程使用的研缽需要高溫乾燥處理後使用。（2） 實驗中使用的EP管，槍頭等塑膠製品，需要用DEPC水浸泡24小時後，經高溫滅菌乾燥使用。（3） 為了防止Rnase的汙染，用DEPC水替代三蒸水進行溶液的配製。（4） RNA操作中使用專用的器械，有條件的也可以設定專用實驗室。
7、外源性的RNase會汙染玻璃、塑膠製品、實驗器械、及各種實驗試劑。操作過程中，手套是最容易汙染樣品的，因此手套要勤換。實驗人員說話過程中所帶的唾液會降解樣品，故需帶口罩操作。在RNA整個提取過程中，實驗人員熟練快速的完成整個RNA的提取，減少實驗所用的時間。
實驗準備以及所用試劑
1。trizol試劑
2。氯仿（三氯甲烷）
3。異丙醇
4。 75%乙醇（DEPC水配製）
5。 RNA酶滅活劑
6。 逆轉錄試劑
7。 DEPC水
8。無水乙醇
9。2000的marker
10。瓊脂糖
11。EB替代
12。小鑷子
13。大小EP管架
14。注射器
15。手套，口罩
16。移液槍
17。DEPC水泡過的槍頭
試劑的儲存
1。 氯仿又叫三氯甲烷，一般儲存在4℃冰箱中
2。 trizol試劑，2到8℃儲存
3。 cDNA -80℃儲存
4。 RNAsafe -20℃儲存
5。 2X power Taq PCR MasterMix -20℃儲存
6。 逆轉錄試劑 -20℃儲存
7。 PCR產物儲存：一般在4℃冰箱儲存，長時間不用可-20℃凍存。
