Western，也稱Western blot、Western blotting、Western 印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。
一、蛋白提取
組織樣蛋白提取方法
（需要準備的試劑和儀器：ripa裂解液、PBS溶液、組織樣本、勻漿器或研磨儀、離心機、超聲儀破碎、冰盒）
1。用滅菌的工具分離新鮮的組織50mg-100mg，並預冷的生理鹽水或PBS洗滌乾淨，用潔淨的剪刀將組織剪成可放入2ml離心管的小塊。
2。將組織放入勻漿器或研磨儀中，加入適量的含有蛋白酶抑制劑（必要時需加入磷酸酶抑制劑）的ripa裂解液（每20mg中加入150-250ul裂解液），置於冰上研磨2-5min，直到無肉眼可見的團塊，冰浴裂解30min，讓組織細胞充分裂解。
3。超聲處理10-15s，以完成細胞裂解並剪下DNA，以降低樣品粘度和提升蛋白溶解度。（注意為確保組織細胞充分裂解，建議進行超聲破碎。調節超聲儀至合適的頻率與功率，將超聲探頭置於樣本裂解液中部，但不觸碰管壁或管底，進行水浴超聲。超聲迴圈設定如下：超聲3s，暫停10s，重複3-5次）。
4。超聲處理後將樣品置於冰上孵育30min。
5。將上述裂解樣品，於4℃，12000rpm，離心15-20min，取上清到一個新的EP管，置於冰上備用
細胞樣品蛋白提取方法
（需要準備的試劑和儀器：ripa裂解液、PBS溶液、細胞樣本、超聲儀破碎、離心機、冰盒）
1。 對於貼壁細胞：從培養物中吸出培養基，用預冷的 1× PBS 洗滌細胞後，加入含有蛋白酶抑制劑 （ 必要時還要加入
磷酸酶抑制劑 ） 的 RIPA 裂解液 （6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直徑的平板 500 µl） 來裂解細胞，然後立即從板上刮下細胞
並將提取物轉移至 EP 管，置於冰上。
2。 對於懸浮細胞：將懸浮細胞連同培養基轉移到 15ml 離心管，室溫 1000rpm 離心 5min，收集細胞沉澱，然後加
入含有蛋白酶抑制劑 （ 必要時還要加入磷酸酶抑制劑 ） 的 RIPA 裂解液 （6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直徑的平板 500 µl），
用加樣器吸打幾次後轉入一個新的 EP 管，置於冰上來裂解細胞。
3。 超聲處理 10–15s，以完成細胞裂解並剪下 DNA，以降低樣品粘度和提升蛋白溶解度。
注意：為確保組織細胞充分裂解，建議進行超聲破碎。調節超聲儀至適宜頻率與功率 （ 超聲功率不宜過大，並設定超
聲間歇，以防止超聲探頭過度產熱 ），將超聲探頭置於樣本裂解液中部，但不觸碰管壁或管底，進行冰浴超聲。
超聲迴圈設定如下：
超聲 3s，暫停 10s，重複 3-5 次。
4。 超聲處理後將樣品繼續置於冰上孵育 30min。
5。 將上述裂解後樣品，於 4℃，12 000rpm，離心 15-20min，取上清到一個新的 EP 管，置於冰上備用。2、電泳（Electrophoresis）
二、蛋白定量
微孔酶標儀法
1. 配製工作液：根據標準品和樣品數量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配製成BCA工作液，充分混勻(混合時可能會有渾濁，但混勻後就會消失)。BCA工作液室溫24小時內穩定。
2. 稀釋標準品：取10μL BSA標準品用PBS稀釋至100μL（樣品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/mL。將標準品按0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20μL加到96孔板的蛋白標準品孔中，加PBS補足至20μL。
準品按 0，1，2，4，8，12，16，20ul 加到 96 孔板的蛋白標準品孔中，加 PBS 補足到 20ul。
3. 將樣品作適當稀釋（最好多做幾個梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋），加20μL到96孔板的樣品孔中。由於移液器在取小量樣品時誤差偏大，標準線前面的點可能不很準確，所以儘可能的讓樣品點落在標準線1/2後。
4. 各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置15-30分鐘。用酶標儀測定A562nm，根據標準曲線計算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時，應注意防止因水分蒸發影響檢測結果。
分光光度計法
有酶標儀，可用分
如沒光光度計在離心管中混勻後加入比色皿中比色。
步驟如下：
1. 配製工作液: 根據標準品和樣品數量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配製成BCA工作液，充分混勻(混合時可能會有渾濁，但混勻後就會消失)。BCA工作液室溫24小時內穩定。
2. 稀釋標準品：取100μL BSA標準品用PBS稀釋至1mL（樣品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/mL。
3. 取八支（或者更多）5mL離心管，標上號，按下表加入試劑。
注意：對於過高的樣品濃度，我們建議將樣品用 RIPA 裂解液進行合理稀釋並充分混勻後，再進行一次濃度測定為宜。
三、電泳上樣樣品的製備
1。 在上樣前，建議用提取樣品用的 RIPA 裂解液將製備的組織、細胞蛋白樣品的濃度統一調整為相同濃度並充分混勻，
最好都在 3-5µg/µl。
2。 上樣量為 20-40µg（ 如果是純蛋白，上樣量為 100ng），根據上樣量計算好體積，每管樣品分別與 4× 蛋白上樣緩
衝液按體積比 3：1 混勻。
3。 煮沸 5-10min，使樣品還原變性，然後立即放於冰上備用。
4。 對於剩餘的樣品，可以統一加入 4× 蛋白上樣緩衝液後，將樣品在 -20℃或 -80℃儲存。
四、1.SDS-PAGE 凝膠的製備
根據要檢測的目的蛋白分子量範圍，參考下表選擇合適的分離膠濃度灌製分離膠，加入保護層 （ 可小心加入 0。5ml 去離子水封壓膠面 ）。待分離膠凝固後，倒出保護層的去離子水，再灌注濃縮膠。根據樣品數量和體積，選擇合適的梳子插入濃縮膠。待濃縮膠完全凝固後，小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽內。
分離膠濃度
最佳分離範圍
4-12%
40-270kd
4-20%
15-140kd
8%
70-200kd
10%
30-75kd
12%
25-60kd
五、蛋白上樣與電泳
將上述變性處理後的樣品低速短暫離心後，按照實驗設計的上樣順序，分別加入樣品孔中。最後，加入合適的預染蛋白 Marker。濃縮膠恆壓 80V，分離膠 150V 電壓條件下電泳，直至指示劑溴酚蘭遷移至凝膠底部。如使用預製膠150v電壓跑即可，不需要調整電壓。
電泳合格標準：目的蛋白條帶位於分離膠的中部，並且條帶充分分離。
蛋白轉膜 （ 溼轉法 ）
原理：蛋白因結合 SDS 而帶負電荷，在電場中從膠轉移至膜上。
1。 將 PVDF 膜在無水甲醇中浸泡 1-3min，再孵育於冰冷的電轉緩衝液中 5min。膠也可以在轉膜液中平衡 3-5min，防止轉膜時條帶變形，NC 膜不需要甲醇浸泡，需提前轉膜液浸泡即可。
2。 製作轉膜“三明治”
溼式轉膜三明治排列順序：負極 / 海綿 / 吸水紙 / 膠 / 膜 / 吸水紙 / 海綿 / 正極，全部緊密排列，特別是膠與膜之間不能留有氣泡。
三明治安裝的方向：負極與膠同側，向正極方 （ 膜 ） 遷移。
膜的面積：5。2 * 8。4 cm。
濾紙的面積：4 條邊均略長於膜的 4 條邊。
3。 200-300mA 恆流轉膜，轉膜時間可參考下表。
六、膜的封閉
封閉的作用：為避免作為檢測試劑的特異性一抗與膜發生非特異性結合而造成背景提高，需要對膜上的潛在非特異性結合位點進行封閉處理。
封閉條件：用 TBST 溶解的 5% 的脫脂奶粉或 5% 的 BSA（ 建議提前配製，使奶粉或 BSA 充分溶解 ），室溫封閉 1h。
另外，需注意膜封閉的一些特殊情況：
● 脫脂奶粉成本低，但不能用於磷酸化蛋白檢測。因為脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，使用
脫脂奶粉時，磷酸化抗體可能也會與奶粉中的磷酸化蛋白結合，從而產生高背景。
● 如果是生物素標記的二抗就不宜用牛奶，因為牛奶中含有生物素，用 BSA 效果更好。
● 某些抗體用 BSA 封閉時因不明原因也可能會產生比脫脂奶粉更強的訊號，建議參照抗體說明書進行實驗。
七、一抗的孵育
1。 用 WB 專用一抗稀釋液 （ 對整張膜建議使用 5-10ml），按一定比例 （ 一般為 1：1000-1：2000） 稀釋一抗。
2。 倒掉封閉液，將膜置於適量一抗孵育液中，4℃，水平搖床孵育過夜。
用 TBST 洗膜，3 次，每次 5min。
八、二抗的孵育和洗膜
1。 用 WB 二抗稀釋液按一定比例 （HRP 標記二抗稀釋 1：5000-1：10 000；熒光二抗 1：10000-1：20000） 稀釋二抗。
2。 將膜置於二抗孵育液中，水平搖床室溫孵育 1h。
3。 用 TBST 洗膜，3 次，每次 5min。
目的蛋白質顯影
● 化學發光法 （ 使用 HRP 偶聯的二抗 ）
1。 製備 ECL 工作液：A 液和 B 液等體積的混合，例如 0。5ml A 液和 0。5ml B 液混合，混勻後即可使用。
2。 用量以充分覆蓋印跡膜為準，每 10cm2 膜需要大約 1 ml 工作液。
3。 將印跡膜有蛋白的一面朝上平整的鋪在一張平板上，加上配好的發光底物工作液。
4。 將工作液均勻滴加在印跡膜上，孵育 1-5 min。可將一潔淨的保鮮膜或透明的玻璃紙平整的鋪在孵育有工作液的印
跡膜上，輕輕趕出其間的氣泡。
5。 用合適的照相器材直接記錄蛋白膜的化學發光圖或使用 X 射線膠片曝光 （ 曝光 5 秒至 1 分鐘，透過調整 X 片的曝
光時間獲得最佳結果 ）。
● 熒光底物法 （ 使用熒光二抗 ）
1。 將膜上多餘的 TBST 瀝乾，可使其乾燥。
2。 使用合適的熒光掃描器 （ 如 LI-COR Odyssey 熒光成像系統 ），根據製造商的建議掃描膜上條帶。
四、常見問題和解決方案
