綜合利用基於結構與基於配體的方法理解SD抑制劑的SAR
摘要：小柱孢酮脫水酶（Scytalone Dehydratase，SD）抑制劑可以保護水稻免受稻瘟病菌引起的病害。本文以相差僅一個腈基的SD抑制劑6d與7d為例，綜合利用蛋白相互作用勢、配體場與GIST水熱力學性質分析，來解釋兩者活性差異18000多倍的原因。
1. 前言
小柱孢酮脫水酶（Scytalone Dehydratase，SD）是稻瘟病菌引起的水稻真菌病害的一個關鍵分子靶標，SD抑制劑可以保護水稻免受稻瘟病菌引起的病害。
圖1。 水楊醯胺類SD抑制劑1a及與其相互作用的關鍵水分子，PDB 1STD
杜邦公司報道了一個以水楊醯胺類抑制劑1a（圖1）與SD共晶結構（PDB 1STD）為起點的SD抑制劑開發專案［1］。抑制劑1a除了與蛋白質側鏈（未示出）發生許多疏水相互作用外，還與蛋白質、以及兩個結合水分子形成了氫鍵網路（圖1）。該氫鍵網路可用來解釋抑制劑結合親和力的強弱。然而，活性位點殘基、水分子和抑制劑之間的氫鍵應被認為具有動態特性。其中一個結晶水分子（HOH200）與水楊醯胺羰基氧原子和酪氨酸30和50的酚羥基形成氫鍵。假設該水分子作為普通的酸與兩個酪氨酸殘基結合以誘導底物scytalone烯醇化。第二個水分子（HOH201）與抑制劑1a的NH 、HIS85 、HIS110 的epsilon位氮原子形成氫鍵，被認為是SD催化迴圈中脫水生成的水。
圖2。 SD抑制劑的設計與發展過程（圖片來源於文獻［1］）
有理由相信，如果用生物等排體喹唑啉雜環替換1a的水楊醯胺部分，將保持與兩個水分子的氫鍵網路。喹唑啉雜環是對1a水楊醯胺片段的分子內氫鍵的模擬環化而來，其對SD催化活性的抑制能力已經有文獻公開。預期喹唑啉環的1位氮原子（序號見圖2）將佔據1a羥基的位置以從Asn131的側鏈接收氫鍵。之後的喹唑啉類抑制劑與SD的共晶結構PDB 5STD的解釋證實了這個猜測：這兩個水分子（圖3 HOH537與538）確實還保留著，透過氫鍵介導著抑制劑與蛋白之間的相互作用。重要的是，在氨基上需要合適的大體積疏水取代基來佔據襯有許多疏水氨基酸側鏈的空腔，以便實現有效的抑制。作者認為，稠合雜環可以作為合適的骨架，用於引入官能團以取代活性位點水分子之一。
圖3。 喹唑啉環抑制劑與SD共晶結構（PDB 5STD）揭示的相互作用模式
透過置換這種水分子來獲得在結合親和力上的增益已在文獻中得到了充分認可。首先，將水分子從受限環境中釋放到主體溶劑中，熵增加。其次，有可能與協調水分子的蛋白殘基直接結合、相互作用。第二點是重要的，因為用於結合水分子的空間和靜電環境必須對系統的總自由能提供比由於限制水分子而造成的熵損失更大的焓貢獻。否則，水分子就不會受到這樣的限制。如果抑制劑類似物被設計成取代結合的水分子，則由於水分子而導致的焓穩定性的損失應當部分地透過來自設計的抑制劑的焓貢獻來重新獲得。作者設計的SD抑制劑的演變過程如圖2所示，這裡我重點以其中一對化合物6d與7d（圖4）為例來說明結合水分子替換所代帶的巨大結合親和力（18182倍）收益。Michel等人［2］已經以6d、7d為算例對其中的水分子替換進行了詳細的理論計算解釋，而本文的主要目的是嘗試從分子視覺化、配體場、蛋白分子相互作用勢、GIST溶劑熱力學分析等角度來解釋水分子替換所帶來的結合親和力增益。
圖4。 化合物6d與7d的化學結構式及其Ki值
2. 方法
2。1 蛋白的結構準備
將7d與SD的共晶結構（PDB 3STD）從蛋白質資料庫下載到Flare中，並使用來自Protein Prep工具小心地準備，以新增氫原子、最佳化氫鍵、消除原子衝突並給蛋白結構分配最佳質子化狀態。任何截短的蛋白質鏈被封端作為蛋白質準備的一部分。7d結構從共晶結構3STD中提取出來，而6d結構是根據7d的生物活性構象在結合位點裡刪除腈基得到。
2。2 GIST分析
瞭解蛋白活性位點內水分子的行為是藥物設計的一個非常重要的方面。在蛋白質-配體複合物中，瞭解橋連水分子的穩定性是決定藥物設計策略的關鍵。如果水分子不是特別穩定，可以設計配體以取代它，並與蛋白質活性位點直接相互作用：這通常會導致配體生物活性的增加。GIST是一種水熱力學性質分析方法［3］，用於評估結合口袋的水合作用，並透過在分子動力學執行結束時對顯式溶劑分佈取樣來計算相關的水熱力學性質。GIST分析的結果顯示為活性位點水合作用的三維等值面對映“happy”（綠色，與負∆G相關）和“unhappy”（紅色，與正∆G相關）區域。unhappy區域對映的是蛋白質活性位點內更可能的可成藥區域。happy區域對映的是蛋白結合位點內較低可能成藥的區域，在那裡水分子更穩定，因此更難置換。在本文中，用Flare分別對結合位點的Apo結構（不包含配體、金屬離子與結晶水）進行了GIST分析，使用瞭如下條件：
Calculation method： Normal
Ligand： None
Grid spacing：0。5 Å
Grid Definition：Ligand
Chains： A
Simulation length： 20ns
Solvent Model： explicit TIP4Pew Water
2。3 蛋白相互作用勢分析（PIP）
蛋白相互作用勢（Protein Interaction Potential， PIP）是Cresset分子相互作用勢對蛋白質的延伸，兩者都是使用XED力場計算的。該方法在原理上類似於配體場的計算：蛋白質的活性位點被探針原子充滿，並且計算每個格點上的相互作用勢。該方法利用了Mehler等人［4］的距離依賴的介電函式來更好地處理蛋白質結構中的大量帶電基團。僅計算和顯示活性位點的蛋白質相互作用電勢。
2。4 靜電互補性分析
Flare引入了一種稱為靜電互補性打分（Electrostatic Complementarity score，EC score）的分析方法［5］，它將配體靜電的分析與蛋白靜電的分析結合起來，以產生配體-蛋白質複合物的靜電互補性（EC）的視覺評估和數值評估。基本思想非常簡單：當配體和受體的靜電勢匹配（即具有相同的量值和相反的符號）時，實現配體和受體之間的最大靜電親和力。透過將該方法應用於一系列文獻資料集，分析其視覺和數值分量，表明EC與報道的生物活性差異相關，並能夠預測報道的生物活性差異［5］。我們用Flare的EC技術對化合物進行靜電互補性比較。
2。5 配體場
Cresset XED力場［6。7］透過複雜的原子描述來模擬遠離原子中心的電荷，從而改進了傳統的分子力學。這使得能夠更詳細地描述靜電並優異地重現分子間相互作用。XED力場由Andy Vinter博士開發，在Cresset改進，它正確地模擬了取代基對芳香族化合物的效應、複雜芳香族化合物中電荷密度的變化以及小分子、水和蛋白質之間的分子間相互作用。在本文中，我門用XED力場來描述配體的靜電性質。
3. 理解6d與7d的活性差異
3。1 經典的蛋白-配體相互作用分析與分子對接分析
首先用Ligandscout 4。4分析共晶結構PDB 3STD中蛋白與配體7d的相互作用，如圖5所示。可以發現，兩個大體積親脂性基團被疏水氨基酸包圍，這正是作者想要的。模仿水楊醯胺片段的噌啉片段氮原子作為氫鍵受體與ASN131相互作用。噌啉環上的氨基做為氫鍵供體保留了與結合水HOH517的相互作用。最重要的是，噌啉環上的腈基作為氫鍵受體代替了原先的結合水與TYR30、TYR50發現氫鍵相互作用。
圖5。 共晶結構PDB 3STD的蛋白-配體7d相互作用分析（沒有呈現全部的π-π相互作用）。紅色：氫鍵受體；綠色：氫鍵供體；黃色：疏水中心。
影片1則重點呈現了氫鍵與π-π相互作用，以及相關的氫鍵網路相互作用。注意到，噌啉環上的氨基與HOH517氫鍵相互作用的幾何並不完美，應該以動態的觀點去理解該水的實際作用方式：其氫的取向是可以變化的。但總的來說，HOH517介導的氫鍵網路還如1STD中的HOH201那樣。可以看到7d的腈基做為氫鍵供體模擬了水分子直接與TRY30、TYR50的酚羥基發生氫鍵相互作用，這個相互作用是6d與7d之間在經典相互作用模式上的唯一差別。
https：//www。zhihu。com/video/1439326010164957184
影片1。 7d與SD共晶結構的相互作用分析（疏水相互作用未呈現）。綠色虛線：氫鍵；紫色虛線：π-π或陽離子-π。
接著在“幹”蛋白結合位點（即將所有的結晶水都刪除掉）裡用AutoDock Vina打分函式評價6d、7d的結合親和力，結果如表1所示。可以看到，兩者的疏水貢獻一樣且都非常大，這與分子大體積疏水基團特徵一致；6d比7d的氫鍵相互作用貢獻少了1。8，這主要是由於6d少了腈基而不能與TRY30、50發生氫鍵相互作用。然而，Vina score打分並沒有因為氫鍵作用的差異而將6d與7d區分開來。總的來說，Vina打分不能解釋6d與7d在活性上高達18000多倍的差異。這再次提醒我們，分子對接打分函式並非為預測結合親和力而設計，尤其是在先導化合物最佳化階段應謹慎使用虛擬篩選打分函式來對分子進行優先性排序。表1。 用AutoDock Vina打分函式預測化合物6d與7d的結合親和力
Vina輸入檔案見附件1。
3。2 蛋白相互作用勢與靜電互補性分析
蛋白相互作用勢可以快速地從蛋白角度定性地考察SAR、分析蛋白-配體的靜電互補性。圖6呈現了3STD結合位點的蛋白相互作用勢，可以發現，7d的腈基被一個紅色區塊（正蛋白相互作用勢）包圍而凸顯出來，這提示應該在配體上引入靜電上互補的基團以提高蛋白-配體相互作用。還可以看到，噌啉環氮原子附近的蛋白相互作用勢也為正，這是因為蛋白ASN131醯胺做為氫鍵供體朝向噌啉環而帶來的。
圖6。 共晶結構PDB 3STD的蛋白相互作用勢分析。紅色區塊：正蛋白相互作用勢（eV=13等值圖）；藍色：負蛋白相互作用勢（eV=-8等值圖）。
THR30、50酚羥基附近的正蛋白相互作用勢與6d紅色的正配體場（見圖7左）發生衝突，而與7d藍色的負配體場（見圖7右）互補。6d與7d在噌啉環氮附近均為負配體場與正蛋白相互作用勢互補。
圖7。 6d（左）與7d（右）的配體場。紅色：正配體場；藍色：負配體場
將分子表面用靜電互補性（EC）打分值著色可以直觀地考察EC值在表面上的分佈，它的價值在於視覺化分子在哪裡與蛋白的靜電很好地匹配以及在哪裡與之不匹配。圖8比較了化合物6d與7d分子表面的EC分佈，鑑於兩個分子僅在一處有差異，輕而易舉地凸顯出6d被腈基取代後的對應區域由紅色轉為綠色，這說明腈基取代是靜電有利的，靜電相互作用差異可是兩者活性差異的主要原因之一。
圖8。 6d（左）與7d（右）分子表面靜電互補性分析。紅色：靜電衝突；綠色：靜電互補。
3。3 GIST分析
理想的配體，不僅要在形狀、靜電上與蛋白結合位點互補，而且還要與蛋白結合位點的溶劑熱力學性質相匹配。用Flare/GIST分析PDB 3STD結合位點，結果如圖9所示。可以發現結合位點基本被紅色的區塊佔據，這說明該結合位點具有良好的成藥性。同時我們發現，腈基所在的位置被一個紅色的區塊覆蓋，說明對應位置的水是可置換的。
圖9。 PDB 3STD結合位點Apo結構（不包含溶劑、配體、金屬等）的GIST分析結果。紅色：ΔG=+0。5kcal/mol水平等值圖；綠色：ΔG=-0。5kcal/mol水平等值圖。
為了凸顯能量高的重要的水，繪製了ΔG=+1。0kcal/mol與ΔG=+3。0kcal/mol水平網格狀等值圖，如圖10所示，分別著色為粉紅色與青灰色。可以發現腈基上沒有對應的等值圖出現，這說明腈基置換水而帶來的結合親和力增益（因為水置換相關的熱力學增益）並不是很大，可能不是6d與7d活性差異的主要原因。
圖10。 PDB 3STD結合位點Apo結構（不包含溶劑、配體、金屬等）的GIST分析結果。粉紅色：ΔG=+1。0kcal/mol水平等值圖；青灰色：ΔG=+3。0kcal/mol水平等值圖。
有意思的是，用水分子替換策略來源的共晶結構PDB 5STD進行的GIST分析卻給出略有差異的結果。影片2演示了PDB 5STD結合位點Apo結構的GIST分析結果。紅色網格為ΔG=+0。5kcal/mol水平等值圖，綠色網格為ΔG=-0。5kcal/mol水平等值圖。
影片2。 共晶結構5STD結合位點Apo結構的GIST分析結果。紅色：ΔG=+0。5kcal/mol水平等值圖；綠色：ΔG=-0。5kcal/mol水平等值圖。
可以發現，影片2呈現的ΔG=+0。5kcal/mol水平等值圖與PDB 3STD分析的基本一致。所不同的是，若將等值圖提高到ΔG=+3。0kcal/mol（圖11粉紅色等值圖）與ΔG=+5。0kcal/mol（圖11青灰色等值圖）的時候，5STD的TYR30、50側鏈酚羥基附近的HOH537（圖11）依舊有等值圖覆蓋，在粉紅色等值圖裡有一小點青灰色。也就是說，HOH537位置處的ΔG至少為+5。0kcal/mol，這是一個非常重要的水。
圖11。 PDB 5STD結合位點Apo結構的GIST分析結果。粉紅色：ΔG=+3。0kcal/mol水平等值圖；青灰色：ΔG=+5。0kcal/mol水平等值圖。
雖然根據PDB 3STD與5STD對同一個位置計算的水合自由能存在差異，但無論如何，GIST分析都提示了在Tyr30、50側鏈酚羥基附近重要的可替換的水合位點。綜合之前的蛋白相互作用勢分析，可以知道這個水合位點應該用極性的基團對水進行替換，並且該位點PIP呈強靜電勢，應該引入一個帶負靜電勢的基團做為配體的一部分。對6d的配體場與表面互補性分析則給出了配體在靜電上不匹配的位置。綜合這些資訊，有助於藥化專家設計正確的配體，或者藉助SPARK虛擬篩選而發現活性更高的化合物。
4.小結
總的來說，GIST水熱力學分析可以確認可被替換水的位置；蛋白相互作用勢（PIP）分析可以確認可替換水位置的蛋白靜電特性，同時也定義對與之互補的配體在靜電場性質方面的要求；PIP結合配體場可以進一步確定對用來替換該水的配體片段的性質要求；靜電互補性（EC）分析可進一步考察蛋白與配體在靜電上是否衝突確認修飾位置與方向。綜合這些關鍵的SAR資訊，可以凸顯出配體上重要的藥化修飾位置、指導新分子的設計。根據初步的SAR資訊，可以初步判斷透過引入腈基來引入新的相互作用是7d相比6d活性得以提高18000多倍的主要原因，水分子替換的熱力學貢獻是次要原因。用杜邦公司作者的原話來總結就是：首先，將水分子從受限環境中釋放到主體溶劑中，熵增加。其次，與協調水分子的蛋白殘基直接結合、相互作用。第二點是重要的。。。。
5. 附件
AutoDock Vina輸入檔案：sd_vina。zip
使用方法，以7d化合物為例：
6. 文獻
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本文作者：小墨，轉載出處：綜合利用基於結構與基於配體的方法理解SD抑制劑的SAR
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1/09/15/understanding-the-sar-in-scytalone-dehydratase-inhibitors。html
編譯：肖高鏗
