在過去的幾年中，越來越多的證據表明液液相分離（Liquid-Liquid Phase Separation，LLPS）參與了多種細胞過程，這些無膜液滴狀的成分（如核仁、應激顆粒等）在沒有膜的束縛下依然可以穩定存在，並與周圍環境發生頻繁的物質交換，對於濃縮某些分子和促進細胞功能的時空調節具有重要作用
【1,2】
。“相分離”在免疫系統中也有重要作用（Protein & Cell | 免疫訊號通路中的生物大分子高聚體：超分子複合物與相分離），例如在先天免疫中，DNA感受器 cGAS在DNA存在時形成液滴，其可以充當微型反應器從而大大增強cGAMP的產生，啟用STING以產生I型干擾素
【3】
；在適應性免疫中的另一個例子是，TCR訊號複合物（跨膜蛋白LAT及其結合伴侶）形成液滴狀態以促進T細胞中MAPK訊號和肌動蛋白的聚合
【4】
。
2015年，Richard Flavell和Erol Fikrig實驗室報道腸道特有的Nod樣受體NLRP6在空腸（jejunum）介導識別腦心肌炎病毒和諾如病毒（EMCV and MNV，ssRNA（+））中的重要作用
【5】
，朱書（現就職於中科大）和王鵬華（現就職於康州大學）是該文的並列第一作者。2017年，Richard Flavell和Harry Greenberg實驗室再次報道另外一個腸道特異表達Nod樣受體NLRP9b在迴腸（ileum）識別雙鏈RNA病毒——輪狀病毒（rotavirus）的重要作用，並發現NLRP6有一定直接結合雙鏈RNA（dsRNA）的能力但是NLRP9b是間接結合dsRNA
【6】
。朱書和丁思遠（現就職於華盛頓大學聖路易斯分校）是該文的並列第一作者。Nod樣受體在十多年前就被發現可以在配體啟用的情況下形成炎症小體（inflammasome）聚集，但是一直未有確切的證據證明此過程中有相分離的發生。而有趣的是，大部分液相分離是由核酸及其結合蛋白形成的
【1,7】
，因此潛在的RNA識別受體NLRP6成為了研究炎症小體和LLPS關聯的突破口。
2021年10月21日，哈佛大學醫學院吳皓課題組聯合中國科學技術大學
朱書
課題組在
Cell
發表題為
Phase Separation Drives RNA Virus-Induced Activation of the NLRP6 Inflammasome
的研究論文，
發現了dsRNA可以誘導NLRP6發生相分離進而啟用炎症小體抗病毒免疫反應。
研究人員首先純化了NLRP6蛋白，針對目前報道的一系列NLRP6的潛在配體dsRNA，LTA，metabolites，LPS
【5,8-10】
等透過一系列體外實驗（EMSA、MST）確定dsRNA和NLRP6的結合最強（Kd=1。2±0。2μM）且隨著RNA的長度增加親和力也隨之增加，此外LTA也可以和NLRP6結合，但親和力稍弱（Kd=6。5±0。8μM）。
隨後研究人員發現dsRNA與NLRP6在體外以及細胞中都可以形成液滴聚集體，研究人員透過熒光漂白恢復實驗以及凝聚體融合等實驗證明了dsRNA與NLRP6的確透過液液相分離形成凝聚體
（圖一）
。
圖一 dsRNA在體外和細胞內誘導NLRP6液液相分離
那麼dsRNA與NLRP6是如何形成液液相分離的呢？研究人員透過光控（Opto-genetics）等實驗發現NLRP6蛋白序列中含有內在無序區（IDR），在對IDR序列進行比對的過程中發現高頻的帶正電荷氨基酸——賴氨酸在不同物種中具有高度保守性，這提示著該區域對於液液相分離的形成具有特殊的意義。多價相互作用已經被證明在液液相分離中起到關鍵作用，核酸與蛋白質形成的靜電相互作用導致多價相互作用的形成也有許多研究報道
【1,2】
。因此研究人員猜測NLRP6 IDR區域的多個賴氨酸重複介導的多價相互作用介導了LLPS的形成。的確，體外表達純化突變體以及細胞內外源表達突變體等實驗表明多個賴氨酸是dsRNA與NLRP6液液相分離的重要結構
（圖二）
。
圖二 NLRP6 IDR介導的液液相分離
為了探究賴氨酸對液液相分離的影響，研究人員構建了賴氨酸突變體，透過體外表達純化蛋白及一系列的細胞實驗發現，突變體的確抑制了NLRP6的液液相分離，透過光控實驗發現其多價相互作用較野生型小，且會影響NLRP6的自我聚集。同時功能試驗表明，細胞外源表達突變體較野生型而言明顯抑制NLRP6炎症小體的啟用——細胞焦亡的產生，以上證據表明，
多個賴氨酸區域是啟動NLRP6液液相分離以及後續炎症小體啟用的關鍵，多價相互作用是NLRP6液液相分離的關鍵作用力（圖三）
。
圖三 賴氨酸突變體抑制NLRP6液液相分離
進一步地，研究人員想在小鼠體內探究液液相分離的作用。NLRP6之前被報道在腸道上皮細胞高表達
【5】
，研究人員也發現NLRP6也可以特異表達在肝實質細胞（NLRP3和NLRP9b均不表達）。鑑於NLRP6在腸道和肝臟的高表達，研究人員構建了輪狀病毒（Rotavirus， RV）感染腸道和小鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus，MHV）感染肝臟的病毒感染模型。在輪狀病毒感染實驗中，研究人員發現NLRP6敲除小鼠的腸道的GSDMD剪下減弱以及IL-18分泌明顯下降，說明NLRP6在腸道缺失會顯著抑制輪狀病毒感染啟用的炎症小體。同時，研究人員也對野生型以及NLRP6敲除小鼠進行了MHV感染，同樣發現病毒感染後NLRP6敲除小鼠的GSDMD剪下以及IL-18分泌明顯較野生型小鼠減少，並且當敲除NLRP6或其它炎症小體組分時，病毒載量均較野生型升高，以上證據充分說明MHV感染小鼠導致NLRP6炎症小體的啟用，NLRP6敲除會抑制炎症小體啟用，導致病毒感染增多。為了進一步檢測小鼠體內凝聚體的形成，透過免疫熒光實驗發現在野生型小鼠的肝臟切片中出現了dsRNA與NLRP6以及ASC與NLRP6形成的凝聚體，而該凝聚體在NLRP6敲除小鼠無法形成，說明MHV感染的確可以誘導NLRP6凝聚體的形成。
那麼如果阻斷液液相分離，是否對體內的病毒感染有影響呢？研究人員透過CRISPR Cas9技術構建了賴氨酸突變鼠，對其分別進行了RV和MHV感染，檢測突變小鼠的腸道炎症小體，發現與NLRP6敲除相似的現象—GSDMD剪下明顯減少以及IL-18分泌減少，在MHV模型中檢測肝臟切片發現突變鼠的凝聚體明顯減少，且炎症小體的啟用明顯受到抑制，以上證據說明賴氨酸的突變（抑制液液相分離）抑制了NLRP6炎症小體的啟用。
該論文的創新之處在於：
1.首次提供明確的證據炎症小體形成過程中發生了LLPS；2. NLRP6識別RNA形成LLPS作為一個介導訊號通路的平臺，解釋了NLRP6介導和整合多種訊號（RNA，LTA，inflammasome, interferon）的能力；3. 首次透過構建Ploy K突變小鼠影響NLRP6多價相互作用的方式證明LLPS在生理條件下的功能。
哈佛大學醫學院吳皓教授和中國科學技術大學免疫學研究所朱書教授為論文共同通訊作者，吳皓教授課題組負責了本文體外現象和機制的研究，朱書教授課題組負責本文中細胞現象和機制，以及小鼠模型的研究。哈佛大學醫學院吳皓課題組的Chen Shen （沈辰） 和中國科學技術大學朱書課題組的博士研究生Runzhi Li （李潤智） 為共同第一作者。本工作得到了中國科大田志剛教授，耶魯大學Richard Flavell教授，生物物理所高璞研究員，中國科大周榮斌教授、金騰川教授，北京大學胡家志教授、季雄教授，中山大學郭德銀教授的幫助。
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.032
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朱書教授實驗室招收博士後（免疫學方向，微生物方向特別是具有噬菌體研究經驗，神經生物學方向），共同探索腸道免疫系統與微生物的相互調控及其對健康和疾病的影響。腸道作為人體最大的粘膜免疫器官，聚集了遠超過人體細胞數目的微生物和全身一半以上的免疫細胞。我們和合作者一起發現腸道先天免疫系統 （NLRs）如何識別腸道病原微生物 （Cell， 2021； PNAS， 2020； Nature， 2017； Science， 2015）， 以及共生微生物（Nature Immunology， 2019）； 同時發現腸道輔助型T細胞及其分泌的細胞因子如何介導針對腸道微生物的免疫反應 （Nature， 2017； Nature Medicine， 2012； J Exp Med， 2010）。並綜述了腸道免疫系統對於腸道病原以及共生微生物的識別及應對（Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology， 2020； Mol Aspect Med， 2020； Cell Mol Immunol， 2019）。我們誠邀免疫學方向，微生物方向，以及神經生物學方向的博士後共同研究腸道免疫識別微生物以及微生物對免疫的調控，以及潛在干預腸道免疫和微生物在自身免疫疾病、感染、腫瘤、神經系統疾病中的應用。更多資訊見實驗室網頁：
https：//
biox。ustc。edu。cn/2017/0
125/c692a340183/page。htm
；
http：//
zhulab。ustc。edu。cn/
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