第四章 蛋白質
提要
一。 概念
簡單蛋白、結合蛋白、基本氨基酸、等電點、甲醛滴定法、Edman降解、一級結構、肽鍵、構型與構象、二面角、二級結構、超二級結構、結構域、三級結構、四級結構、亞基、別構蛋白、分子病、水化層、雙電層、蛋白質的變性與復性、鹽析與鹽溶
二。氨基酸
分類、基本氨基酸的結構、分類、名稱、符號、化學反應、鑑定、蛋白質的水解
三。蛋白質的結構
一級結構 結構特點、測定步驟、常用方法、酶
二級結構 四種 結構特點、資料、超二級結構
三級結構 主要靠疏水鍵維持
四級結構 變構現象
結構與功能的適應、結構變化對功能的影響、典型蛋白質
四。蛋白質的性質
分子量的測定方法、酸鹼性、溶解性、變性、顏色反應
第一節
蛋白質通論
一、蛋白質的功能多樣性
蛋白質是原生質的主要成分，任何生物都含有蛋白質。自然界中最小、最簡單的生物是病毒，它是由蛋白質和核酸組成的。沒有蛋白質也就沒有生命。
自然界的生物多種多樣，因而蛋白質的種類和功能也十分繁多。概括起來，蛋白質主要有以下功能：
1。催化功能 生物體內的酶都是由蛋白質構成的，它們有機體新陳代謝的催化劑。沒有酶，生物體內的各種化學反應就無法正常進行。例如，沒有澱粉酶，澱粉就不能被分解利用。
2。結構功能 蛋白質可以作為生物體的結構成分。在高等動物裡，膠原是主要的細胞外結構蛋白，參與結締組織和骨骼作為身體的支架，佔蛋白總量的1/4。細胞裡的片層結構，如細胞膜、線粒體、葉綠體和內質網等都是由不溶性蛋白與脂類組成的。動物的毛髮和指甲都是由角蛋白構成的。
3。運輸功能 脊椎動物紅細胞中的血紅蛋白和無脊椎動物體內的血藍蛋白在呼吸過程中起著運輸氧氣的作用。血液中的載脂蛋白可運輸脂肪，轉鐵蛋白可轉運鐵。一些脂溶性激素的運輸也需要蛋白，如甲狀腺素要與甲狀腺素結合球蛋白結合才能在血液中運輸。
4。貯存功能 某些蛋白質的作用是貯存氨基酸作為生物體的養料和胚胎或幼兒生長髮育的原料。此類蛋白質包括蛋類中的卵清蛋白、奶類中的酪蛋白和小麥種子中的麥醇溶蛋白等。肝臟中的鐵蛋白可將血液中多餘的鐵儲存起來，供缺鐵時使用。
5。運動功能 肌肉中的肌球蛋白和肌動蛋白是運動系統的必要成分，它們構象的改變引起肌肉的收縮，帶動機體運動。細菌中的鞭毛蛋白有類似的作用，它的收縮引起鞭毛的擺動，從而使細菌在水中游動。
6。防禦功能 高等動物的免疫反應是機體的一種防禦機能，它主要也是透過蛋白質（抗體）來實現的。凝血與纖溶系統的蛋白因子、溶菌酶、干擾素等，也擔負著防禦和保護功能。
7。調節功能 某些激素、一切激素受體和許多其他調節因子都是蛋白質。
8。資訊傳遞功能 生物體內的資訊傳遞過程也離不開蛋白質。例如，視覺資訊的傳遞要有視紫紅質參與，感受味道需要味覺蛋白。視杆細胞中的視紫紅質，只需1個光子即可被激發，產生視覺。
9。遺傳調控功能 遺傳資訊的儲存和表達都與蛋白質有關。DNA在儲存時是纏繞在蛋白質（組蛋白）上的。有些蛋白質，如阻遏蛋白，與特定基因的表達有關。β－半乳糖苷酶基因的表達受到一種阻遏蛋白的抑制，當需要合成β－半乳糖苷酶時經過去阻遏作用才能表達。
10。其他功能 某些生物能合成有毒的蛋白質，用以攻擊或自衛。如某些植物在被昆蟲咬過以後會產生一種毒蛋白。白喉毒素可抑制生物蛋白質合成。
二、蛋白質的分類
（一）按分子形狀分類
1。球狀蛋白 外形近似球體，多溶於水，大都具有活性，如酶、轉運蛋白、蛋白激素、抗體等。球狀蛋白的長度與直徑之比一般小於10。
2。纖維狀蛋白 外形細長，分子量大，大都是結構蛋白，如膠原蛋白，彈性蛋白，角蛋白等。纖維蛋白按溶解性可分為可溶性纖維蛋白與不溶性纖維蛋白。前者如血液中的纖維蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等，後者如膠原蛋白，彈性蛋白，角蛋白等結構蛋白。
（二）按分子組成分類
1。簡單蛋白 完全由氨基酸組成，不含非蛋白成分。如血清清蛋白等。根據溶解性的不同，可將簡單蛋白分為以下7類：清蛋白、球蛋白、組蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白。
2。結合蛋白 由蛋白質和非蛋白成分組成，後者稱為輔基。根據輔基的不同，可將結合蛋白分為以下7類：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血紅素蛋白、黃素蛋白和金屬蛋白。
三、蛋白質的元素組成與分子量
1。元素組成 所有的蛋白質都含有碳氫氧氮四種元素，有些蛋白質還含有硫、磷和一些金屬元素。
蛋白質平均含碳50％，氫7％，氧23％，氮16％。其中氮的含量較為恆定，而且在糖和脂類中不含氮，所以常透過測量樣品中氮的含量來測定蛋白質含量。如常用的凱氏定氮：
蛋白質含量＝蛋白氮×6。25
其中6。25是16％的倒數。
2。蛋白質的分子量 蛋白質的分子量變化範圍很大，從6000到100萬或更大。這個範圍是人為規定的。一般將分子量小於6000的稱為肽。不過這個界限不是絕對的，如牛胰島素分子量為5700，一般仍認為是蛋白質。蛋白質煮沸凝固，而肽不凝固。較大的蛋白質如菸草花葉病毒，分子量達4000萬。
四、蛋白質的水解
氨基酸是蛋白質的基本結構單位，這個發現是從蛋白質的水解得到的。蛋白質的水解主要有三種方法：
1。酸水解 用6MHCl或4MH2SO4，105℃迴流20小時即可完全水解。酸水解不引起氨基酸的消旋，但色氨酸完全被破壞，絲氨酸和蘇氨酸部分破壞，天冬醯胺和谷氨醯胺的醯胺基被水解。如樣品含有雜質，在酸水解過程中常產生腐黑質，使水解液變黑。用3mol/L對甲苯磺酸代替鹽酸，得到色氨酸較多，可像絲氨酸和蘇氨酸一樣用外推法求其含量。
2。鹼水解 用5MNaOH，水解10－20小時可水解完全。鹼水解使氨基酸消旋，許多氨基酸被破壞，但色氨酸不被破壞。常用於測定色氨酸含量。可加入澱粉以防止氧化。
3。酶水解 酶水解既不破壞氨基酸，也不引起消旋。但酶水解時間長，反應不完全。一般用於部分水解，若要完全水解，需要用多種酶協同作用。
第二節
氨基酸
一、氨基酸的結構與分類
（一）基本氨基酸
組成蛋白質的20種氨基酸稱為基本氨基酸。它們中除脯氨酸外都是α-氨基酸，即在α-碳原子上有一個氨基。基本氨基酸都符合通式，都有單字母和三字母縮寫符號。
按照氨基酸的側鏈結構，可分為三類：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和雜環氨基酸。
1。脂肪族氨基酸 共15種。
側鏈只是烴鏈：Gly， Ala， Val， Leu， Ile後三種帶有支鏈，人體不能合成，是必需氨基酸。
側鏈含有羥基：Ser， Thr許多蛋白酶的活性中心含有絲氨酸，它還在蛋白質與糖類及磷酸的結合中起重要作用。
側鏈含硫原子：Cys， Met兩個半胱氨酸可透過形成二硫鍵結合成一個胱氨酸。二硫鍵對維持蛋白質的高階結構有重要意義。半胱氨酸也經常出現在蛋白質的活性中心裡。甲硫氨酸的硫原子有時參與形成配位鍵。甲硫氨酸可作為通用甲基供體，參與多種分子的甲基化反應。
側鏈含有羧基：Asp（D）， Glu（E）
側鏈含醯胺基：Asn（N）， Gln（Q）
側鏈顯鹼性：Arg（R）， Lys（K）
2。芳香族氨基酸 包括苯丙氨酸（Phe，F）和酪氨酸（Tyr，Y）兩種。 酪氨酸是合成甲狀腺素的原料。
3。雜環氨基酸 包括色氨酸（Trp，W）、組氨酸（His）和脯氨酸（Pro）三種。其中的色氨酸與芳香族氨基酸都含苯環，都有紫外吸收（280nm）。所以可透過測量蛋白質的紫外吸收來測定蛋白質的含量。組氨酸也是鹼性氨基酸，但鹼性較弱，在生理條件下是否帶電與周圍內環境有關。它在活性中心常起傳遞電荷的作用。組氨酸能與鐵等金屬離子配位。脯氨酸是唯一的仲氨基酸，是α-螺旋的破壞者。
B是指Asx，即Asp或Asn；Z是指Glx，即Glu或Gln。
基本氨基酸也可按側鏈極性分類：
非極性氨基酸：Ala， Val， Leu， Ile， Met， Phe， Trp， Pro共八種
極性不帶電荷：Gly， Ser， Thr， Cys， Asn， Gln， Tyr共七種
帶正電荷：Arg， Lys， His
帶負電荷：Asp， Glu
（二）不常見的蛋白質氨基酸
某些蛋白質中含有一些不常見的氨基酸，它們是基本氨基酸在蛋白質合成以後經羥化、羧化、甲基化等修飾衍生而來的。也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、鎖鏈素等。其中羥脯氨酸和羥賴氨酸在膠原和彈性蛋白中含量較多。在甲狀腺素中還有3，5-二碘酪氨酸。
（三）非蛋白質氨基酸
自然界中還有150多種不參與構成蛋白質的氨基酸。它們大多是基本氨基酸的衍生物，也有一些是D-氨基酸或β、γ、δ-氨基酸。這些氨基酸中有些是重要的代謝物前體或中間產物，如瓜氨酸和鳥氨酸是合成精氨酸的中間產物，β-丙氨酸是遍多酸（泛酸，輔酶A前體）的前體，γ-氨基丁酸是傳遞神經衝動的化學介質。
二、氨基酸的性質
（一）物理性質
α-氨基酸都是白色晶體，每種氨基酸都有特殊的結晶形狀，可以用來鑑別各種氨基酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶於水中。脯氨酸和羥脯氨酸還能溶於乙醇或乙醚中。
除甘氨酸外，α-氨基酸都有旋光性，α-碳原子具有手性。蘇氨酸和異亮氨酸有兩個手性碳原子。從蛋白質水解得到的氨基酸都是L-型。但在生物體內特別是細菌中，D-氨基酸也存在，如細菌的細胞壁和某些抗菌素中都含有D-氨基酸。
三個帶苯環的氨基酸有紫外吸收，F：257nm，ε=200； Y：275nm，ε=1400； W：280nm，ε=5600。通常蛋白質的紫外吸收主要是後兩個氨基酸決定的，一般在280nm。
氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在水溶液中以偶極離子的形式存在。所以氨基酸晶體是離子晶體，熔點在200℃以上。氨基酸是兩性電解質，各個解離基的表觀解離常數按其酸性強度遞降的順序，分別以K1’、K2’來表示。當氨基酸分子所帶的淨電荷為零時的pH稱為氨基酸的等電點（pI）。等電點的值是它在等電點前後的兩個pK’值的算術平均值。
氨基酸完全質子化時可看作多元弱酸，各解離基團的表觀解離常數按酸性減弱的順序，以pK1’ 、pK2’ 、pK3’表示。氨基酸可作為緩衝溶液，在pK’處的緩衝能力最強，pI處的緩衝能力最弱。
氨基酸的滴定曲線如圖。
（二）化學性質
1。氨基的反應
（1）醯化
氨基可與醯化試劑，如醯氯或酸酐在鹼性溶液中反應，生成醯胺。該反應在多肽合成中可用於保護氨基。
（2）與亞硝酸作用
氨基酸在室溫下與亞硝酸反應，脫氨，生成羥基羧酸和氮氣。因為伯胺都有這個反應，所以賴氨酸的側鏈氨基也能反應，但速度較慢。常用於蛋白質的化學修飾、水解程度測定及氨基酸的定量。
（3）與醛反應
氨基酸的α-氨基能與醛類物質反應，生成西佛鹼-C=N-。西佛鹼是氨基酸作為底物的某些酶促反應的中間物。賴氨酸的側鏈氨基也能反應。氨基還可以與甲醛反應，生成羥甲基化合物。由於氨基酸在溶液中以偶極離子形式存在，所以不能用酸鹼滴定測定含量。與甲醛反應後，氨基酸不再是偶極離子，其滴定終點可用一般的酸鹼指示劑指示，因而可以滴定，這叫甲醛滴定法，可用於測定氨基酸。
（4）與異硫氰酸苯酯（PITC）反應
α-氨基與PITC在弱鹼性條件下形成相應的苯氨基硫甲醯衍生物（PTC-AA），後者在硝基甲烷中與酸作用發生環化，生成相應的苯乙內醯硫脲衍生物（PTH-AA）。這些衍生物是無色的，可用層析法加以分離鑑定。這個反應首先為Edman用來鑑定蛋白質的N-末端氨基酸，在蛋白質的氨基酸順序分析方面佔有重要地位。
（5）磺醯化
氨基酸與5-（二甲胺基）萘-1-磺醯氯（DNS-Cl）反應，生成DNS-氨基酸。產物在酸性條件下（6NHCl）100℃也不破壞，因此可用於氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有強熒光，激發波長在360nm左右，比較靈敏，可用於微量分析。
（6）與DNFB反應
氨基酸與2，4-二硝基氟苯（DNFB）在弱鹼性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸）。這一反應是定量轉變的，產物黃色，可經受酸性100℃高溫。該反應曾被英國的Sanger用來測定胰島素的氨基酸順序，也叫桑格爾試劑，現在應用於蛋白質N-末端測定。
（7）轉氨反應
在轉氨酶的催化下，氨基酸可脫去氨基，變成相應的酮酸。
2。羧基的反應
羧基可與鹼作用生成鹽，其中重金屬鹽不溶於水。羧基可與醇生成酯，此反應常用於多肽合成中的羧基保護。某些酯有活化作用，可增加羧基活性，如對硝基苯酯。將氨基保護以後，可與二氯亞碸或五氯化磷作用生成醯氯，在多肽合成中用於活化羧基。在脫羧酶的催化下，可脫去羧基，形成伯胺。
3茚三酮反應
氨基酸與茚三酮在微酸性溶液中加熱，最後生成藍色物質。而脯氨酸生成黃色化合物。根據這個反應可透過二氧化碳測定氨基酸含量。
4。側鏈的反應
絲氨酸、蘇氨酸含羥基，能形成酯或苷。
半胱氨酸側鏈巰基反應性高：
（1）二硫鍵（disulfide bond）
半胱氨酸在鹼性溶液中容易被氧化形成二硫鍵，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫鍵在形成蛋白質的構象上起很大的作用。氧化劑和還原劑都可以開啟二硫鍵。在研究蛋白質結構時，氧化劑過甲酸可以定量地拆開二硫鍵，生成相應的磺酸。還原劑如巰基乙醇、巰基乙酸也能拆開二硫鍵，生成相應的巰基化合物。由於半胱氨酸中的巰基很不穩定，極易氧化，因此利用還原劑拆開二硫鍵時，往往進一步用碘乙醯胺、氯化苄、N-乙基丁烯二亞醯胺和對氯汞苯甲酸等試劑與巰基作用，把它保護起來，防止它重新氧化。
（2）烷化
半胱氨酸可與烷基試劑，如碘乙酸、碘乙醯胺等發生烷化反應。
半胱氨酸與丫丙啶反應，生成帶正電的側鏈，稱為S-氨乙基半胱氨酸（AECys）。
（3）與重金屬反應
極微量的某些重金屬離子，如Ag+、Hg2+，就能與巰基反應，生成硫醇鹽，導致含巰基的酶失活。
5。 以下反應常用於氨基酸的檢驗：
l 酪氨酸、組氨酸能與重氮化合物反應（Pauly反應），可用於定性、定量測定。組氨酸生成棕紅色的化合物，酪氨酸為桔黃色。
l 精氨酸在氫氧化鈉中與1-萘酚和次溴酸鈉反應，生成深紅色，稱為坂口反應。用於胍基的鑑定。
l 酪氨酸與硝酸、亞硝酸、硝酸汞和亞硝酸汞反應，生成白色沉澱，加熱後變紅，稱為米倫反應，是鑑定酚基的特性反應。
l 色氨酸中加入乙醛酸後再緩慢加入濃硫酸，在介面會出現紫色環，用於鑑定吲哚基。
在蛋白質中，有些側鏈基團被包裹在蛋白質內部，因而反應很慢甚至不反應。
三、色譜與氨基酸的分析分離
1。色譜（chromatography）的發展史
最早的層析實驗是俄國植物學家Цвет在1903年用碳酸鈣分離葉綠素，屬於吸附層析。40年代出現了分配層析，50年代出現了氣相色譜，60年代出現HPLC，80年代出現了超臨界層析，90年代出現的超微量HPLC可分離ng級的樣品。
2。色譜的分類：
按流動相可分為氣相、液相、超臨界色譜等；
按介質可分為紙層析、薄層層析、柱層析等；
按分離機制可分為吸附層析、分配層析、分子篩層析等
3。色譜的應用
可用於分離、製備、純度鑑定等。
定性可透過保留值、內標、標準曲線等方法，定量一般用標準曲線法。
氨基酸的分析分離是測定蛋白質結構的基礎。在分配層析和離子交換層析法開始應用於氨基酸成分分析之後，蛋白質結構的研究才取得了顯著的成就。現在這些方法已自動化。
氨基酸從強酸型離子交換柱的洗脫順序如下：
Asp，Thr，Ser，Glu，Pro，Gly，Ala，Cys，Val，Met，Ile，Leu，Tyr，Phe，Lys，His，（NH3），Arg
第三節
蛋白質的一級結構
蛋白質是生物大分子，具有明顯的結構層次性，由低層到高層可分為一級結構、二級結構、三級結構和四級結構。
一、肽鍵和肽
一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基縮水形成的共價鍵，稱為肽鍵。在蛋白質分子中，氨基酸借肽鍵連線起來，形成肽鏈。
最簡單的肽由兩個氨基酸組成，稱為二肽。含有三、四、五個氨基酸的肽分別稱為三肽、四肽、五肽等。肽鏈中的氨基酸由於形成肽鍵時脫水，已不是完整的氨基酸，所以稱為殘基。肽的命名是根據組成肽的氨基酸殘基來確定的。一般從肽的氨基端開始，稱為某氨基醯某氨基醯…某氨基酸。肽的書寫也是從氨基端開始。
肽鍵象醯胺鍵一樣，由於鍵內原子處於共振狀態而表現出較高的穩定性。在肽鍵中C－N單鍵具有約40％雙鍵性質，而C=O雙鍵具有40％單鍵性質。這樣就產生兩個重要結果：（1）肽鍵的亞氨基在pH 0-14的範圍內沒有明顯的解離和質子化的傾向；（2）肽鍵中的C－N單鍵不能自由旋轉，使蛋白質能摺疊成各種三維構象。
除了蛋白質部分水解可以產生各種簡單的多肽以外，自然界中還有長短不等的小肽，它們具有特殊的生理功能。
動植物細胞中含有一種三肽，稱為谷胱甘肽，即δ-谷氨醯半胱氨醯甘氨酸。因其含有巰基，故常以GSH來表示。它在體內的氧化還原過程中起重要作用。腦啡肽是天然止痛劑。肌肉中的鵝肌肽是一個二肽，即β-丙氨醯組氨酸。肌肽可作為肌肉中的緩衝劑，緩衝肌肉產生的乳酸對pH的影響。一種抗菌素叫做短桿菌酪肽，由12種氨基酸組成，其中有幾種是D-氨基酸。這些天然肽中的非蛋白質氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。許多激素也是多肽，如催產素、加壓素、舒緩激肽等。
二、肽的理化性質
小肽的理化性質與氨基酸類似。許多小肽已經結晶。晶體的熔點很高，說明是離子晶體，在水溶液中以偶極離子存在。肽鍵的亞氨基不解離，所以肽的酸鹼性取決於肽的末端氨基、羧基和側鏈上的基團。在長肽或蛋白質中，可解離的基團主要是側鏈上的。肽中末端羧基的pK’比自由氨基酸的稍大，而末端氨基的pK’則稍小。側鏈基團變化不大。
肽的滴定曲線和氨基酸的很相似。肽的等電點也可以根據它的pK’值確定。
一般小肽的旋光度等於各個氨基酸旋光度的總和，但較大的肽或蛋白質的旋光度不等於其組成氨基酸的旋光度的簡單加和。
肽的化學性質和氨基酸一樣，但有一些特殊的反應，如雙縮脲反應。一般含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都能與CuSO4鹼性溶液發生雙縮脲反應而生成紫紅色或藍紫色的複合物。利用這個反應可以測定蛋白質的含量。
三、一級結構的測定
（一）一級結構
蛋白質的一級結構是指肽鏈的氨基酸組成及其排列順序。氨基酸序列是蛋白質分子結構的基礎，它決定蛋白質的高階結構。一級結構可用氨基酸的三字母符號或單字母符號表示，從N-末端向C-末端書寫。採用三字母符號時，氨基酸之間用連字元（－）隔開。
（二）測定步驟
測定蛋白質的一級結構，要求樣品必須是均一的（純度大於97％）而且是已知分子量的蛋白質。一般的測定步驟是：
1。透過末端分析確定蛋白質分子由幾條肽鏈構成。
2。將每條肽鏈分開，並分離提純。
3。肽鏈的一部分樣品進行完全水解，測定其氨基酸組成和比例。
4。肽鏈的另一部分樣品進行N末端和C末端的鑑定。
5。拆開肽鏈內部的二硫鍵。
6。 肽鏈用酶促或化學的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，並將各個肽段分離出來。
7。測定每個肽段的氨基酸順序。
8。從第二步得到的肽鏈樣品再用另一種部分水解方法水解成另一套肽段，其斷裂點與第五步不同。分離肽段並測序。比較兩套肽段的氨基酸順序，根據其重疊部分拼湊出整個肽鏈的氨基酸順序。
9。 測定原來的多肽鏈中二硫鍵和醯胺基的位置。
（三）常用方法
1。 末端分析
（1）N末端
蛋白質的末端氨基與2，4-二硝基氟苯（DNFB）在弱鹼性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白質（DNP-蛋白質）。產物黃色，可經受酸性100℃高溫。水解時，肽鏈斷開，但DNP基並不脫落。DNP-氨基酸能溶於有機溶劑（如乙醚）中，這樣可與其他氨基酸和ε-DNP賴氨酸分開。再經雙向濾紙層析或柱層析，可以鑑定黃色的DNP氨基酸。
丹磺醯氯法是更靈敏的方法。蛋白質的末端氨基與5-（二甲胺基）萘-1-磺醯氯（DNS-Cl）反應，生成DNS-蛋白質。DNS-氨基酸有強熒光，激發波長在360nm左右，比DNFB法靈敏100倍。
目前應用最廣泛的是異硫氰酸苯酯（PITC）法。末端氨基與PITC在弱鹼性條件下形成相應的苯氨基硫甲醯衍生物，後者在硝基甲烷中與酸作用發生環化，生成相應的苯乙內醯硫脲衍生物而從肽鏈上掉下來。產物可用氣-液色譜法進行鑑定。這個方法最大的優點是剩下的肽鏈仍是完整的，可依照此法重複測定新生的N末端氨基酸。現在已經有全自動的氨基酸順序分析儀，可測定含20個以上氨基酸的肽段的氨基酸順序。缺點是不如丹磺醯氯靈敏，可與之結合使用。
N末端氨基酸也可用酶學方法即氨肽酶法測定。
（2）C末端
a） C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應的α氨基醇。肽鏈水解後，再用層析法鑑定。有斷裂干擾。
b）另一個方法是肼解法。多肽與肼在無水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉變為相應的醯肼化合物。肼解下來的C末端氨基酸可用紙層析鑑定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬醯胺和谷氨醯胺被破壞。
c） 也可用羧肽酶法鑑定。將蛋白質在pH 8。0， 30℃與羧肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據氨基酸的量與時間的關係，就可以知道C末端氨基酸的排列順序。羧肽酶A水解除精氨酸、賴氨酸和脯氨酸外所有肽鍵，羧肽酶B水解精氨酸和賴氨酸。
2。二硫鍵的拆開和肽鏈的分離
一般情況下，蛋白質分子中肽鏈的數目應等於N末端氨基酸殘基的數目，可根據末端分析來確定一種蛋白質由幾條肽鏈構成。必須設法把這些肽鏈分離開來，然後測定每條肽鏈的氨基酸順序。如果這些肽鏈之間不是共價交聯的，可用酸、鹼、高濃度的鹽或其他變性劑處理蛋白質，把肽鏈分開。如果肽鏈之間以二硫鍵交聯，或肽鏈中含有鏈內二硫鍵，則必須用氧化或還原的方法將二硫鍵拆開。最普遍的方法是用過量的巰基乙醇處理，然後用碘乙酸保護生成的半胱氨酸的巰基，防止重新氧化。二硫鍵拆開後形成的個別肽鏈，可用紙層析、離子交換柱層析、電泳等方法進行分離。
3。肽鏈的完全水解和氨基酸組成的測定。
在測定氨基酸順序之前，需要知道多肽鏈的氨基酸組成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測定氨基酸。目前用氨基酸自動分析儀，2－4小時即可完成。
蛋白質的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質中所含的氨基酸分子數表示。不同種類的蛋白質，其氨基酸組成相差很大。
4。肽鏈的部分水解和肽段的分離
當肽鏈的氨基酸組成及N末端和C末端已知後，隨後的步驟是肽鏈的部分水解。這是測序工作的關鍵步驟。這一步通常用專一性很強的蛋白酶來完成。
最常用的是胰蛋白酶（trypsin），它專門水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵，所以生成的肽段之一的C末端是賴氨酸或精氨酸。用丫丙啶處理，可增加酶切位點（半胱氨酸）；用馬來酸酐（順丁烯二酸酐）保護賴氨酸的側鏈氨基，或用1，2-環己二酮修飾精氨酸的胍基，可減少酶切位點。
經常使用的還有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水殘基的羧基形成的肽鍵。其他疏水殘基反應較慢。
用溴化氰處理，可斷裂甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵。水解後甲硫氨酸殘基轉變為C末端高絲氨酸殘基。以上三種方法經常使用。
胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。前者水解疏水殘基之間的肽鍵，後者水解疏水殘基的氨基形成的肽鍵。
金葡菌蛋白酶，又稱穀氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解穀氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽鍵，但受緩衝液影響。在醋酸緩衝液中只水解穀氨酸，在磷酸緩衝液中還可水解天冬氨酸。
梭狀芽孢桿菌蛋白酶，水解精氨酸羧基形成的肽鍵，又稱精氨酸蛋白酶。耐變性劑，可經受6M尿素2小時。可用於水解不易溶解的蛋白。
凝血酶，水解Arg-Gly肽鍵。
羥胺可水解Asn-Gly，但Asn-Leu和 Asn-Ala也能部分裂解。
以上方法中，酶不能水解脯氨酸參與形成的肽鍵。
多肽部分水解後，降解成長短不一的小肽段，可用層析或電泳加以分離提純。經常用雙向層析或電泳分離，再用茚三酮顯色，所得的圖譜稱為肽指紋譜。
5。多肽鏈中氨基酸順序的測定
從多肽鏈中部分水解得到的肽段可用化學法或酶法測序，然後比較用不同方法獲得的兩套肽段的氨基酸順序，根據它們彼此重疊的部分，確定每個肽段的適當位置，拼湊出整個多肽鏈的氨基酸順序。
6。二硫鍵位置的確定
一般用蛋白酶水解帶有二硫鍵的蛋白質，從部分水解產物中分離出含二硫鍵的肽段，再拆開二硫鍵，將兩個肽段分別測序，再與整個多肽鏈比較，即可確定二硫鍵的位置。常用胃蛋白酶，因其專一性低，生成的肽段小，容易分離和鑑定，而且可在酸性條件下作用（pH2），此時二硫鍵穩定。肽段的分離可用對角線電泳，將混合物點到濾紙的中央，在pH6。5進行第一次電泳，然後用過甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變成一對含半胱氨磺酸的肽段。將濾紙旋轉90度後在相同條件下進行第二次電泳，多數肽段遷移率不變，處於對角線上，而含半胱氨磺酸的肽段因負電荷增加而偏離對角線。用茚三酮顯色，分離，測序，與多肽鏈比較，即可確定二硫鍵位置。
四、多肽合成
多肽的人工合成有兩種型別，一種是由不同氨基酸按照一定順序排列的控制合成，另一種是由一種或兩種氨基酸聚合或共聚合。控制合成的一個困難是進行接肽反應所需的試劑，能同時和其他官能團反應。因此在接肽以前必須首先將這些基團加以封閉或保護，肽鍵形成後再除去保護基。這樣每連線一個氨基酸殘基都要經過幾個步驟，要得到較長的肽鏈就必須每步都有較高的產率。如果每一步反應產率都是90%，那麼30次反應後總產率只有4。24%。
保護基必須在接肽時起保護作用，在接肽後容易除去，又不引起肽鍵斷裂。最常用的氨基保護基Y是苄氧甲醯基，可用催化加氫或用金屬鈉在液氨中處理除去。其他還有三苯甲基、叔丁氧甲醯基等，可用稀鹽酸或乙酸在室溫下除去。
羧基保護基Z通常用烷基，如乙基，可在室溫下皂化除去。如用苄基，可用催化加氫除去。
肽鍵不能自發形成，常用縮合劑促進肽鍵形成。接肽用的縮合劑最有效的是N，N’-二環己基碳二亞胺（DC CI）。DCCI從兩個氨基酸分子中奪取一分子水，自身變為不溶的N，N’-二環己基脲，從反應液中沉澱出來，可過濾除去。接肽反應除用縮合劑以外，還可用分別活化參加形成肽鍵的羧基和氨基的方法。羧基活化可用疊氮化物法和活化酯法（對硝基苯酯）等；氨基活化一般不需特殊手段，通常在接肽時加入有機鹼，如三乙胺，保證氨基在自由狀態即可。
近年來固相多肽合成迅速發展。在固相合成中，肽鏈的逐步延長是在不溶的聚苯乙烯樹脂小圓珠上進行的。合成多肽的羧基端先和氯甲基聚苯乙烯樹脂反應，形成苄酯。第二個氨基酸的氨基用叔丁氧甲醯基保護後，以DCCI為縮合劑，接在第一個氨基酸的氨基上。重複這個方法，可使肽鏈按一定順序延長。最後把樹脂懸浮在無水三氟乙酸中，通入乾燥HBr，使多肽與樹脂分離，同時除去保護基。整個合成過程現在已經可以在自動化固相多肽合成儀上進行。平均合成每個肽鍵只需三小時。此法可用於醫藥工業。人工合成的催產素沒有混雜的加壓素，比提取的天然藥品好。已經成功合成含124個殘基的蛋白。
第四節
蛋白質的高階結構
蛋白質的多肽鏈並不是線形伸展的，而是按一定方式摺疊盤繞成特有的空間結構。蛋白質的三維構象，也稱空間結構或高階結構，是指蛋白質分子中原子和基團在三維空間上的排列、分佈及肽鏈的走向。高階結構是蛋白質表現其生物功能或活性所必須的，包括二級、三級和四級結構。Primary structure， secondary， tertiary， quaternary structure
一、有關概念
1。 構型configration與構象conformation
構型指立體異構體中取代原子或基團在空間的取向，構型的改變必須透過共價鍵的斷裂。構象是指這些取代基團當單鍵旋轉時可能形成的不同的立體結構，構象的改變不涉及共價鍵的改變。
2。 二面角
因為肽鍵不能自由旋轉，所以肽鍵的四個原子和與之相連的兩個α碳原子共處一個平面，稱肽平面。肽平面內的C=O與N－H呈反式排列，各原子間的鍵長和鍵角都是固定的。肽鏈可看作由一系列剛性的肽平面透過α碳原子連線起來的長鏈，主鏈的構象就是由肽平面之間的角度決定的。主鏈上只有α碳原子連線的兩個鍵是單鍵，可自由旋轉。繞Cα－N1旋轉的角稱Φ，而繞Cα－C2旋轉的角稱Ψ。這兩個角稱為二面角。規定當旋轉鍵兩側的肽鏈成順式時為0度。取值範圍是正負180度，當二面角都是180度時肽鏈完全伸展。由於空間位阻，實際的取值範圍是很有限的。
二、二級結構
（一）二級結構是肽鏈的空間走向
蛋白質的二級結構是指肽鏈主鏈的空間走向（摺疊和盤繞方式），是有規則重複的構象。肽鏈主鏈具有重複結構，其中氨基是氫鍵供體，羰基是氫鍵受體。透過形成鏈內或鏈間氫鍵可以使肽鏈捲曲摺疊形成各種二級結構單元。複雜的蛋白質分子結構，就由這些比較簡單的二級結構單元進一步組合而成。
（二）肽鏈捲曲摺疊形成四種二級結構單元
1。α螺旋（α-helix） α螺旋模型是Pauling和Corey等研究α-角蛋白時於1951年提出的。角蛋白是動物的不溶性纖維狀蛋白，是由動物的表皮衍生而來的。它包括面板的表皮以及毛髮、鱗、羽、甲、蹄、角、絲等。角蛋白可分為兩類，一類是α角蛋白，胱氨酸含量豐富，如角、甲、蹄的蛋白胱氨酸含量高達22％；另一類是β角蛋白，不含胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸的含量很高，蠶絲絲心蛋白就屬於這一類。α角蛋白，如頭髮，暴露於溼熱環境中幾乎可以伸長一倍，冷卻乾燥後又收縮到原來長度。β角蛋白則無此變化。
α角蛋白的X射線衍射圖案極其相似，沿長軸方向都有一個大週期結構或重複單位，其長度為5－5。5埃。Pauling等考慮到肽平面對多肽鏈構象的限制作用，設計了多肽鏈摺疊的各種可能模型，發現其中一種α螺旋模型能很好地說明α角蛋白的X射線衍射圖案中的5－5。5埃重複單位。在這個模型中，每隔3。6個氨基酸殘基螺旋上升一圈，相當於向上平移5。4埃。螺旋的直徑是11埃。螺旋上升時，每個氨基酸殘基沿軸旋轉100°，向上平移1。5埃，比完全伸展的構象壓縮2。4倍。這與衍射圖案中的小週期完全一致。其二面角Φ=-57度，Ψ=-48度。在α螺旋中氨基酸殘基的側鏈伸向外側，相鄰的螺圈之間形成鏈內氫鍵，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。氫鍵是由肽鍵中氮原子上的氫與其N端第四個羰基上的氧之間形成的。α螺旋的結構允許所有的肽鍵都參與鏈內氫鍵的形成，因此相當穩定。α-螺旋由氫鍵構成一個封閉環，其中包括三個殘基，共13個原子，稱為3。613（n=3）螺旋。
由L型氨基酸構成的多肽鏈可以捲曲成右手螺旋，也可捲曲成左手螺旋，但右手螺旋比較穩定。因為在左手螺旋中β碳與羰基過於接近，不穩定。在天然蛋白質中，幾乎所有α螺旋都是右手螺旋。只在嗜熱菌蛋白酶中發現一圈左手螺旋。在α角蛋白中，3或7個α螺旋可以互相擰在一起，形成三股或七股的螺旋索，彼此以二硫鍵交聯在一起。α螺旋不僅是α角蛋白的主要構象，在其他纖維蛋白和球狀蛋白中也廣泛存在，是一種常見的二級結構。
α螺旋是一種不對稱的分子結構，具有旋光能力。α螺旋的比旋不等於其中氨基酸比旋的簡單加和，因為它的旋光性是各個氨基酸的不對稱因素和構象本身不對稱因素的總反映。天然α螺旋的不對稱因素引起偏振面向右旋轉。利用α螺旋的旋光性，可以測定它的相對含量。
一條肽鏈能否形成α螺旋，以及螺旋的穩定性怎樣，與其一級結構有極大關係。脯氨酸由於其亞氨基少一個氫原子，無法形成氫鍵，而且Cα－N鍵不能旋轉，所以是α螺旋的破壞者，肽鏈中出現脯氨酸就中斷α螺旋，形成一個“結節”。此外，側鏈帶電荷及側鏈基團過大的氨基酸不易形成α螺旋，甘氨酸由於側鏈太小，構象不穩定，也是α螺旋的破壞者。
根據各種殘基的特性，可以預測蛋白質的二級結構。目前常見的預測方法有Chou-Fasman法、GOR法、Lim法等，都是根據統計資訊進行預測的。如果二級結構的預測成功率大於80％，就可以用來預測高階結構，但目前只能達到70％左右。Chou-Fasman法比較直觀，與二級結構形成的實際過程接近，但成功率不高。
Chou-Fasman法根據各個氨基酸在一些已知結構的蛋白質中的表現，按構象引數Pα（表示形成α螺旋的能力） 由大到小將他們分為六組，依次為：
最強的形成者（Hα）：Glu、Met、Ala、Leu
中等的形成者（hα）：Lys、Phe、Gln、Trp、Ile、Val
很弱的形成者（Iα）：Asp、His
中立者（iα）：Cys、Ser、Thr、Arg
較弱的破壞者（bα）：Asn、Tyr
最強的破壞者（Bα）：Gly、Pro
如肽鏈中6個連續的殘基中有4個hα即可形成核心，然後向兩側延伸，遇到四肽破壞者時中止。形成α螺旋時有協同性，即一旦形成核心，其它殘基就容易加入。
2。β-摺疊（β-pleated sheet） β-摺疊也叫β-片層，在β-角蛋白如蠶絲絲心蛋白中含量豐富。其X射線衍射圖案與α-角蛋白拉伸後的圖案很相似。在此結構中，肽鏈較為伸展，若干條肽鏈或一條肽鏈的若干肽段平行排列，相鄰主鏈骨架之間靠氫鍵維繫。氫鍵與鏈的長軸接近垂直。為形成最多的氫鍵，避免相鄰側鏈間的空間障礙，鋸齒狀的主鏈骨架必須作一定的摺疊（φ=－139°，ψ=＋135°），以形成一個摺疊的片層。側鏈交替位於片層的上方和下方，與片層垂直。
β摺疊有兩種型別，一種是平行式，即所有肽鏈的氨基端在同一端；另一種是反平行式，即所有肽鏈的氨基端按正反方向交替排列。從能量上看，反平行式更為穩定。絲心蛋白和多聚甘氨酸是反平行，拉伸α角蛋白形成的β角蛋白是平行式。反平行式的重複距離是7。0埃（兩個殘基），平行式是6。5埃。
在絲心蛋白中，每隔一個氨基酸就是甘氨酸，所有在片層的一面都是氫原子；在另一面，側鏈主要是甲基，因為除甘氨酸外，丙氨酸是主要成分。如果肽鏈中側鏈過大，並帶有同種電荷，則不能形成β摺疊。拉伸後的α角蛋白之所以不穩定，容易復原，就是因為側鏈體積大，電荷高。
3。β轉角 β轉角使肽鏈形成約180°的迴轉，第一個氨基酸的羰基與第四個氨基酸的氨基形成氫鍵。這種結構在球狀蛋白中廣泛存在，可佔全部殘基的1/4。多位於球狀蛋白的表面，空間位阻較小處。又分為Ⅰ型、Ⅱ型與III型。
4。無規捲曲 指沒有一定規律的鬆散肽鏈結構。此結構看來雜亂無章，但對一種特定蛋白又是確定的，而不是隨意的。在球狀蛋白中含有大量無規捲曲，傾向於產生球狀構象。這種結構有高度的特異性，與生物活性密切相關，對外界的理化因子極為敏感。酶的活性中心往往位於無規捲曲中。
除以上常見二級結構單元外，還有其他新發現的結構，如Ω環，由10個殘基組成，象希臘字母Ω。
5。超二級結構
相鄰的二級結構單元可組合在一起，相互作用，形成有規則，在空間上能辨認的二級結構組合體，充當三級結構的構件，稱為超二級結構。常見的有三種：
αα：由兩股或三股右手α螺旋彼此纏繞形成的左手超螺旋，重複距離約為140埃。由於超螺旋，與獨立的α螺旋略有偏差。
βαβ：β摺疊之間由α螺旋或無規捲曲連線。
βββ：由一級結構上連續的反平行β摺疊透過緊湊的β轉角連線而成。包括β曲折和回形拓撲。
三、蛋白質的三級結構
三級結構是指多肽鏈中所有原子和基團的構象。它是在二級結構的基礎上進一步盤曲摺疊形成的，包括所有主鏈和側鏈的結構。哺乳動物肌肉中的肌紅蛋白整個分子由一條肽鏈盤繞成一箇中空的球狀結構，全鏈共有8段α螺旋，各段之間以無規捲曲相連。在α螺旋肽段間的空穴中有一個血紅素基團。所有具有高度生物學活性的蛋白質幾乎都是球狀蛋白。三級結構是蛋白質發揮生物活性所必須的。
在三級結構中，多肽鏈的盤曲摺疊是由分子中各氨基酸殘基的側鏈相互作用來維持的。二硫鍵是維持三級結構唯一的一種共價鍵，能把肽鏈的不同區段牢固地連線在一起，而疏水性較強的氨基酸則借疏水力和範德華力聚整合緊密的疏水核，有極性的殘基以氫鍵和鹽鍵相結合。在水溶性蛋白中，極性基團分佈在外側，與水形成氫鍵，使蛋白溶於水。這些非共價鍵雖然較微弱，但數目龐大，因此仍然是維持三級結構的主要力量。
較大蛋白的三級結構往往由幾個相對獨立的三維實體構成，這些三維實體稱為結構域。結構域是在三級結構與超二級結構之間的一個組織層次。一條長的多肽鏈，可先摺疊成幾個相對獨立的結構域，再締合成三級結構。這在動力學上比直接摺疊更為合理。
結構域在功能上也有其意義。結構域常有相對獨立的生理功能，如一些要分泌到細胞外的蛋白，其訊號肽（負責使蛋白透過細胞膜）就構成一個結構域。此外，還有與殘基修飾有關的結構域、與酶原啟用有關的結構域等。各結構域之間常常只有一段肽鏈相連，稱為鉸鏈區。鉸鏈區柔性較強，使結構域之間容易發生相對運動，所以酶的活性中心常位於結構域之間。小蛋白多由一個結構域構成，由多個結構域構成的蛋白一般分子量大，結構複雜。
四、蛋白質的四級結構
由兩條或兩條以上肽鏈透過非共價鍵構成的蛋白質稱為寡聚蛋白。其中每一條多肽鏈稱為亞基，每個亞基都有自己的一、二、三級結構。亞基單獨存在時無生物活性，只有相互聚合成特定構象時才具有完整的生物活性。四級結構就是各個亞基在寡聚蛋白的天然構象中空間上的排列方式。胰島素可形成二、六聚體，但不是其功能單位，所以不是寡聚蛋白。判斷標準是將發揮生物功能的最小單位作為一個分子。
最簡單的寡聚蛋白是血紅蛋白。它是由兩條α鏈和兩條β鏈構成的四聚體，分子量65000。分子外形近似球狀，每個亞基都和肌紅蛋白類似。血紅蛋白與氧結合時，α和β鏈都發生了轉動，引起四個亞基間的接觸點上的變化。兩個α亞基相互接近，兩個β亞基則離開。
當酸、熱或高濃度的尿素、胍等變性因子作用於寡聚蛋白時，後者會發生構象變化。這種變化可分為兩步：首先是亞基彼此解離，然後分開的亞基伸展而成無規線團。如小心處理，可將寡聚蛋白的亞基拆開，而不破壞其三級結構。如血紅蛋白可用鹽解離成兩個半分子，即兩個α、β亞基。當透析除去過量的鹽後，分開的亞基又可重新結合而恢復活性。如果處理條件強烈，則亞基的多肽鏈完全展開。這樣要恢復天然構象雖很困難，但有些寡聚蛋白仍可恢復。如醛縮酶經酸處理後，其4個亞基完全伸展成無規捲曲，當pH恢復到7左右時，又可恢復如初。這說明一級結構規定了亞基間的結合方式，四級結構的形成也遵從“自我裝配”的原則。
五、結構舉例
（一）纖維狀蛋白
角蛋白
角蛋白是動物的不溶性纖維狀蛋白，是由動物的表皮衍生而來的。它包括面板的表皮以及毛髮、鱗、羽、甲、蹄、角、絲等。角蛋白可分為兩類，一類是α角蛋白，胱氨酸含量豐富，如角、甲、蹄的蛋白胱氨酸含量高達22％；另一類是β角蛋白，不含胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸的含量很高，蠶絲絲心蛋白就屬於這一類。α角蛋白，如頭髮，暴露於溼熱環境中幾乎可以伸長一倍，冷卻乾燥後又收縮到原來長度。β角蛋白則無此變化。
頭髮主要是由α角蛋白構成的。三股右手螺旋形成左手超螺旋，稱為原纖維，直徑2奈米。原纖維再排列成“9＋2”的電纜式結構，稱為微纖維，直徑8奈米。成百根微纖維結合成不規則的纖維束，稱大纖維，直徑200奈米。頭髮周圍是鱗狀細胞，中間是皮層細胞。皮層細胞的直徑是20微米，是由許多大纖維沿軸向平行排列而成的。
膠原
膠原是動物體內含量最豐富的結構蛋白，構成面板、骨胳、軟骨、肌腱、牙齒的主要纖維成分。膠原共有4種，結構相似，都由原膠原構成。其一級結構中甘氨酸佔1/3，脯氨酸、羥脯氨酸和羥賴氨酸含量也較高。賴氨酸可用來結合糖基。原膠原是一個三股的螺旋杆，是由三股特殊的左手螺旋構成的右手超螺旋。這種螺旋的形成是由於大量的脯氨酸和甘氨酸造成的。羥脯氨酸和羥賴氨酸的羥基也參與形成氫鍵，起著穩定這種結構的作用。羥脯氨酸和羥賴氨酸都是蛋白合成後經羥化酶催化而羥化的。在膠原中每隔2個殘基有一個甘氨酸，只有處於甘氨酸氨基端的脯氨酸才能被羥化。羥化是在脯氨醯羥化酶的催化下進行的，這個酶需要維生素C使其活性中心的鐵原子保持亞鐵狀態。缺少維生素C會使羥化不完全，膠原熔點低，不能正常形成纖維，造成面板損傷和血管脆裂，引起出血、潰爛，即壞血病。所以維生素C又叫抗壞血酸。
成纖維細胞合成原膠原的前體，並分泌到結締組織的細胞外空間，形成超螺旋結構，再經酶切，即成原膠原。原膠原之間平行排列，互相錯開1/4，構成膠原的基本結構。一個原膠原的頭和另一個原膠原的尾之間有40奈米的空隙，其中填充磷酸鈣，即骨的無機成分。
膠原的特殊的結構和組成使它不受一般蛋白酶的水解，但可被膠原酶水解。在變態的蝌蚪的尾鰭中就含有這種酶。
3。彈性蛋白
能伸長到原來長度的幾倍，並可很快恢復原來長度。在韌帶、血管壁等處含量較大。
含1/3的甘氨酸，脯氨酸和賴氨酸也較多。羥脯氨酸和羥賴氨酸含量很少。彈性蛋白形成的螺旋由兩種區段組成，一種是富含甘氨酸、脯氨酸和纈氨酸的左手螺旋，一種是富含丙氨酸和賴氨酸的右手α螺旋。賴氨酸之間形成鎖鏈素或賴氨醯正亮氨酸，使鏈間發生交聯，具有很大的彈性。因為鎖鏈素可連線二、三或四條肽鏈，形成網狀結構，所以彈性蛋白可向各個方向作可逆伸展。
4。肌球蛋白和肌動蛋白
兩種可溶性纖維蛋白，構成肌肉的主要成分。前者構成粗絲，後者構成細絲。細絲沿粗絲的滑動導致肌肉的伸縮，引起肌體動作。這一過程需要其它物質的參與和ATP供能。
（二）球狀蛋白
1。 肌紅蛋白
肌肉中用來儲存氧。海洋哺乳動物的肌肉中含大量肌紅蛋白，因而可長時間潛水。抹香鯨每千克肌肉中含80克肌紅蛋白，比人高10倍，所以其肌肉呈棕色。
分子量16700，單結構域。由8段α螺旋構成一個球狀結構，親水基團多在外層。血紅素輔基位於一個疏水洞穴中，這樣可避免其亞鐵離子被氧化。亞鐵離子與卟啉形成4個配位鍵，第五個配位鍵與93位組氨酸結合，空餘的一個配位鍵可與氧可逆結合。其氧合曲線為雙曲線。
2。血紅蛋白
由4個亞基構成一個四面體構型，每個亞基的三級結構都與肌紅蛋白相似，但一級結構相差較大。成人主要是HbA，由兩個α亞基和兩個β亞基構成，兩個β亞基之間有一個DPG（二磷酸甘油酸），它與β亞基形成6個鹽鍵，對血紅蛋白的四級結構起著穩定的作用。因為其結構穩定，所以不易與氧結合。當一個亞基與氧結合後，會引起四級結構的變化，使其它亞基對氧的親和力增加，結合加快。反之，一個亞基與氧分離後，其它亞基也易於解離。所以血紅蛋白是變構蛋白，其氧合曲線是S形曲線，只要氧分壓有一個較小的變化即可引起氧飽和度的較大改變。這有利於運輸氧，肺中的氧分壓只需比組織中稍微高一些，血紅蛋白就可以完成運氧工作。
第五節
蛋白質結構與功能的關係
蛋白質多種多樣的生物功能是以其化學組成和極其複雜的結構為基礎的。這不僅需要一定的結構還需要一定的空間構象。蛋白質的空間構象取決於其一級結構和周圍環境，因此研究一級結構與功能的關係是十分重要的。
一、蛋白質一級結構與功能的關係
（一）種屬差異
對不同機體中表現同一功能的蛋白質的一級結構進行詳細比較，發現種屬差異十分明顯。例如比較各種哺乳動物、鳥類和魚類等胰島素的一級結構，發現它們都是由51個氨基酸組成的，其排列順序大體相同但有細微差別。不同種屬的胰島素其差異在A鏈小環的8、9、10和B鏈30位氨基酸殘基。說明這四個氨基酸殘基對生物活性並不起決定作用。起決定作用的是其一級結構中不變的部分。有24個氨基酸始終不變，為不同種屬所共有。如兩條鏈中的6個半胱氨酸殘基的位置始終不變，說明不同種屬的胰島素分子中AB鏈之間有共同的連線方式，三對二硫鍵對維持高階結構起著重要作用。其他一些不變的殘基絕大多數是非極性氨基酸，對高階結構起著穩定作用。
對不同種屬的細胞色素C的研究同樣指出具有同種功能的蛋白質在結構上的相似性。細胞色素C廣泛存在於需氧生物細胞的線粒體中，是一種含血紅素輔基的單鏈蛋白，由124個殘基構成，在生物氧化反應中起重要作用。對100個種屬的細胞色素C的一級結構進行了分析，發現親緣關係越近，其結構越相似。人與黑猩猩、猴、狗、金槍魚、飛蛾和酵母的細胞色素C比較，其不同的氨基酸殘基數依次為0、1、10、21、31、44。細胞色素C的氨基酸順序分析資料已經用來核對各個物種之間的分類學關係，以及繪製進化樹。根據進化樹不僅可以研究從單細胞到多細胞的生物進化過程，還可以粗略估計各種生物的分化時間。
（二）分子病
蛋白質分子一級結構的改變有可能引起其生物功能的顯著變化，甚至引起疾病。這種現象稱為分子病。突出的例子是鐮刀型貧血病。這種病是由於病人血紅蛋白β鏈第六位穀氨酸突變為纈氨酸，這個氨基酸位於分子表面，在缺氧時引起血紅蛋白線性凝集，使紅細胞容易破裂，發生溶血。血紅蛋白分子中共有574個殘基，其中2個殘基的變化導致嚴重後果，證明蛋白質結構與功能有密切關係。
用氰酸鉀處理突變的血紅蛋白（HbS），使其N端纈氨酸的α氨基醯胺化，可緩解病情。因為這樣可去掉一個正電荷，與和二氧化碳結合的血紅蛋白相似，不會凝聚。現在正尋找低毒試劑用以治療。
（三）共價修飾
對蛋白質一級結構進行共價修飾，也可改變其功能。如在激素調節過程中，常發生可逆磷酸化，以改變酶的活性。
（四）一級結構的斷裂
一級結構的斷裂可引起蛋白質活性的巨大變化。如酶原的啟用和凝血過程等。
凝血是一個十分複雜的過程。首先是凝血因子XII被血管內皮損傷處帶較多負電荷的膠原啟用，然後透過一系列連續反應，啟用凝血酶原，產生有活性的凝血酶。凝血酶從纖維蛋白中切除4個酸性肽段，減少分子中的負電荷，使其變成不溶性的纖維蛋白，纖維蛋白再彼此聚合成網狀結構，最後形成血凝塊，堵塞血管的破裂部位。
根據啟用凝血因子X的途徑，可分為內源途徑和外援途徑。前者只有血漿因子參與，後者還有血漿外的組織因子參與，一般是機體組織受損時釋放的。內源途徑中凝血因子XII被血管內皮損傷處帶較多負電荷的膠原纖維啟用，也可被玻璃、陶土、棉紗等異物啟用。凝血因子XIIa啟用凝血因子XI，此時接觸活化階段完成，反應轉移到血小板表面進行，稱為磷脂膠粒反應階段，產生凝血因子Xa，最終啟用凝血酶。最後一個階段是凝膠生成階段，產生凝塊。
二、蛋白質的變構現象－高階結構變化對功能的影響
有些小分子物質（配基）可專一地與蛋白質可逆結合，使蛋白質的結構和功能發生變化，這種現象稱為變構現象。變構現象與蛋白質的生理功能有密切聯絡。如血紅蛋白在運輸氧氣時，就有變構現象發生。
血紅蛋白是四聚體，每個亞基含一個血紅素輔基。血紅素中的二價鐵原子能與氧可逆結合，並保持鐵的價數不變。影響血紅蛋白氧的飽和百分數的主要因素是氧分壓和血液pH值。飽和度與氧分壓的關係呈S形曲線，而單亞基的肌紅蛋白則為簡單的雙曲線。S形曲線說明，第一個亞基與氧結合後增加其餘亞基對氧的親和力，而第二、第三個亞基與氧結合同樣增加剩下亞基對氧的親和力。第四個亞基對氧的親和力是第一個亞基的300多倍。反之，當氧分壓降低時，一個氧分子從完全氧和的血紅蛋白中解離出來以後，將加快以後的氧分子的釋放。
血紅蛋白在一定的氧分壓下，氧的飽和百分數隨pH升高而增加。其原因是當血紅蛋白與氧結合時，由於亞基的相互關係改變而發生解離，每結合一分子氧，釋放一個質子。pH對氧-血紅蛋白的平衡影響稱為波爾（Bohr）效應。由於波爾效應，血紅蛋白除運輸氧以外，還有緩衝血液pH值的作用。
HbO2+H++CO2=HbH+CO2+O2
氧合曲線也受到溫度的影響。溫度升高會使P50（一半血紅蛋白被氧飽和時的氧分壓）升高，即親和力減弱。所以魚類在溫度升高時會缺氧，是由於水中氧分壓的降低和血紅蛋白對氧親和力的減弱雙重作用的結果。
氧的S型曲線結合和波爾效應使血紅蛋白的輸氧能力達到最高。血紅蛋白可在較窄的氧分壓範圍內完成輸氧功能，使機體內氧水平不會發生很大起伏。血紅蛋白的變構現象使它具有上述優越性。
第六節
蛋白質的性質
一、蛋白質的分子量測定
（一）根據化學組成測定最低分子量
用化學分析方法測出蛋白質中某一微量元素的含量，並假設分子中只有一個這種元素的原子，就可以計算出蛋白質的最低分子量。例如，肌紅蛋白含鐵0。335%，其最低分子量可依下式計算：
最低分子量＝鐵的原子量÷鐵的百分含量×100
計算結果為16700，與其他方法測定結果極為接近，可見肌紅蛋白中只含一個鐵原子。真實分子量是最低原子量的n倍，n是蛋白質中鐵原子的數目，肌紅蛋白n＝1。血紅蛋白鐵含量也是0。335%，最低分子量也是16700，因為含4個鐵原子，所以n＝4，因此其真實分子量為66800。有時蛋白質分子中某種氨基酸含量很少，也可用這種方法計算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0。58%，最低分子量為35200，用其他方法測得分子量為69000，所以其分子中含兩個色氨酸。最低分子量只有與其他方法配合才能確定真實分子量。
（二）滲透壓法
在理想溶液中，滲透壓是濃度的線性函式，而與溶質的形狀無關。所以可用滲透壓計算蛋白質的分子量。但是實際的高分子溶液與理想溶液有較大偏差，當蛋白質濃度不大時，可用以下公式計算：
M=RT/lim（Π/C）
其中R是氣體常數（0。082），T是絕對溫度，Π是滲透壓（以大氣壓計），濃度單位是g/L。測定時需測定幾個不同濃度的滲透壓，以Π/C對C作圖並外推求出C為零時的Π/C值，帶入公式求出分子量。此方法簡單準確，與蛋白質的形狀和水化程度無關，但要求樣品均一，否則測定結果是樣品中各種蛋白的平均分子量。
（三）沉降分析法
蛋白質在溶液中受到強大離心力作用時，如其密度大於溶液密度，就會沉降。用超速離心機（每分鐘6－8萬轉）測定蛋白質的分子量有兩種方法：沉降速度法和沉降平衡法。
1。沉降速度法 離心時，蛋白質移動，產生介面，介面的移動可用適當的光學系統觀察和拍照。當離心力與溶劑的摩擦阻力平衡時，單位離心場強度的沉降速度為定值，稱為沉降係數。蛋白質的沉降係數（常用S20，w表示）介於1×10-13到200×10-13秒，1×10-13秒稱為一個漂浮單位或斯維德貝格單位。蛋白質的沉降係數與分子形狀有關，所以測定分子量時還要測定有關分子形狀的引數，如擴散係數。可用以下公式計算：
M=RTs÷D（1－Vρ）
其中D是擴散係數，V是蛋白質的偏微分比容，ρ是溶劑的密度。偏微分比容的定義是：當加入1克幹物質於無限大體積的溶劑中時，溶液的體積增量。蛋白質溶於水的偏微分比容約為0。74立方厘米每克。為獲得準確結果，s和D的值應外推到無限稀釋。其中的R是氣體常數，在採用釐米。克。秒制時，等於8。314×107爾格/秒。
沉降分析還可鑑定蛋白均一性。純蛋白只有一個介面，在沉降分析圖形上只有一個峰。
2。沉降平衡法 在離心過程中，外圍高濃度區的蛋白質向中心擴散，如轉速較低，二者可達到穩定平衡。此時測定離心管中不同區域的蛋白濃度，可按下式計算分子量：
M=2RTln（C2/C1）÷［ω2（1－Vρ）（x22－x12）］
其中C2和C1是離軸心距離為x2和x1時的蛋白質濃度。沉降平衡法的優點是不需要擴散係數，且離心速度較低（8000－20000轉每分）。但要達到平衡常常需要幾天時間。
（四）分子排阻層析法
層析柱中填充凝膠顆粒，凝膠的網格大小可透過交聯劑含量控制。小分子物質可進入網格中，流出慢；大分子被排阻在顆粒外，流經距離短，流出快。此方法較簡單，但與分子形狀有關。測分子量時，標準蛋白的分子形狀應與待測蛋白相同。
lgM＝K1－K2 Ve
其中Ve是洗脫體積，即從加樣到出峰時流出的體積，K1和K2是常數，隨實驗條件而定。
（五）SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳
蛋白質電泳時的遷移率與其所帶淨電荷、分子大小和形狀有關，加入SDS後，每克蛋白可結合1。4克SDS，將原有電荷掩蓋，而且使分子變成棒狀。由於凝膠的分子篩效應，相對遷移率μR與分子量有如下關係：
lgM=K1－K2μR
其中K1和K2是與試驗條件有關的常數。用已知分子量的標準蛋白作標準曲線，即可求出未知蛋白的分子量。有些蛋白不適宜採用這個方法，如帶電荷較多的（組蛋白），帶較大輔基的（糖蛋白），結構特殊的（膠原）等。
二、蛋白質的酸鹼性
蛋白質是兩性電解質，分子中的可解離基團主要是側鏈基團，也包括末端氨基和羧基。蛋白質也有等電點，即所帶淨電荷為零的pH值。多數蛋白等電點為中性偏酸，約5左右。偏酸的如胃蛋白酶，等電點為1左右；偏鹼的如魚精蛋白，約為12。
蛋白質在等電點時淨電荷為零，因此沒有同種電荷的排斥，所以不穩定，溶解度最小，易聚集沉澱。同時其粘度、滲透性、膨脹性以及導電能力均為最小。
天然球狀蛋白的可解離基團大部分可被滴定，因為球狀蛋白的極性側鏈基團大都分佈在分子表面。有些蛋白的部分可解離基團不能被滴定，可能是由於埋藏在分子內部或參與氫鍵形成。透過滴定發現可解離基團的pK’值與相應氨基酸中很接近，但不完全相同，這是由於受到鄰近帶電基團的影響。
蛋白質的滴定曲線形狀和等電點在有中性鹽存在的情況下，可以發生明顯的變化。這是由於分子中的某些解離基團可以與中性鹽中的陽離子如鈣、鎂或陰離子如氯、磷酸根等相結合，因此觀察到的等電點在一定程度上決定於介質中的離子組成。沒有其他鹽類存在下，蛋白質質子供體解離出的質子與質子受體結合的質子數相等時的pH稱為等離子點。等離子點對每種蛋白質是一個常數。
各種蛋白的等電點不同，在同一pH時所帶電荷不同，在一電場作用下移動的方向和速度也不同，所以可用電泳來分離提純蛋白質。
三、蛋白質的膠體性質
蛋白質是大分子，在水溶液中的顆粒直徑在1－100奈米之間，是一種分子膠體，具有膠體溶液的性質，如布朗運動、丁達爾現象、電泳、不能透過半透膜及吸附能力等。利用半透膜如玻璃紙、火膠棉、羊皮紙等可分離純化蛋白質，稱為透析。蛋白質有較大的表面積，對許多物質有吸附能力。多數球狀蛋白表面分佈有很多極性基團，親水性強，易吸附水分子，形成水化層，使蛋白溶於水，又可隔離蛋白，使其不易沉澱。一般每克蛋白可吸附0。3到0。5克水。分子表面的可解離基團帶相同電荷時，可與周圍的反離子構成穩定的雙電層，增加蛋白質的穩定性。蛋白質能形成穩定膠體的另一個原因是不在等電點時具有同種電荷，互相排斥。因此在等電點時易沉澱。
四、蛋白質的變性（denaturation）
1。定義：
天然蛋白因受物理或化學因素影響，高階結構遭到破壞，致使其理化性質和生物功能發生改變，但並不導致一級結構的改變，這種現象稱為變性，變性後的蛋白稱為變性蛋白。二硫鍵的改變引起的失活可看作變性。
能使蛋白變性的因素很多，如強酸、強鹼、重金屬鹽、尿素、胍、去汙劑、三氯乙酸、有機溶劑、高溫、射線、超聲波、劇烈振盪或攪拌等。但不同蛋白對各種因素的敏感性不同。
2。表現：
蛋白質變性後分子性質改變，粘度升高，溶解度降低，結晶能力喪失，旋光度和紅外、紫外光譜均發生變化。
變性蛋白易被水解，即消化率上升。同時包埋在分子內部的可反應基團暴露出來，反應性增加。
蛋白質變性後失去生物活性，抗原性也發生改變。
這些變化的原因主要是高階結構的改變。氫鍵等次級鍵被破壞，肽鏈鬆散，變為無規捲曲。由於其一級結構不變，所以如果變性條件不是過於劇烈，在適當條件下還可以恢復功能。如胃蛋白酶加熱至80－90℃時，失去活性，降溫至37℃，又可恢復活力，稱為復性（renaturation）。但隨著變性時間的增加，條件加劇、變性程度也加深，就達到不可逆的變性。
3。影響因素
1）溫度：多數酶在60℃以上開始變性，熱變性通常是不可逆的，少數酶在pH6以下變性時不發生二硫鍵交換，仍可復性。多數酶在低溫下穩定，但有些酶在低溫下會鈍化，其中有些酶的鈍化是不可逆的。如固氮酶的鐵蛋白在0－1℃下15小時就會失活一個可能的原因是寡聚蛋白髮生解聚如TMV的丙酮酸羧化酶。
2）pH：酶一般在pH 4－10範圍較穩定。當pH超過pK幾個單位時，一些蛋白內部基團可能會翻轉到表面，造成變性。如血紅蛋白中的組氨酸在低pH下會出現在表面。
3）有機溶劑：能破壞氫鍵，削弱疏水鍵，還能降低介電常數，使分子內斥力增加，造成肽鏈伸展、變性。
4 胍、尿素等：破壞氫鍵和疏水鍵。硫氰酸胍比鹽酸胍效果好。
5）某些鹽類：鹽溶效應強的鹽類，如氯化鈣、硫氰酸鉀等，有變性作用，可能是與蛋白內部基團或溶劑相互作用的結果。
6）表面活性劑：如SDS-、CTAB+、triton等，triton因為不帶電荷，所以比較溫和，經常用來破碎病毒。
4。變性蛋白的構象
胍和尿素造成的變性一般生成無規捲曲，如果二硫鍵被破壞，就成為線性結構。胍的變性作用最徹底。熱變性和酸、鹼造成的變性經常保留部分緊密構象，可被胍破壞。高濃度有機溶劑變性時可能發生螺旋度上升，稱為重構造變性。
5。復性
根據蛋白質結構與變性程度和復性條件不同，復性會有不同結果。有時可以完全復性，恢復所有活力；有時大部分復性，但保留異常區；有些蛋白結構複雜，有多種摺疊途徑，若無適當方法，會生成混合物。
6。變性的防止和利用
研究蛋白質的變性，可採取某些措施防止變性，如新增明膠、樹膠、酶的底物和抑制劑、輔基、金屬離子、鹽類、緩衝液、糖類等，可抑制變性作用。但有些酶在有底物時會降低熱穩定性。有時有機溶劑也可起穩定作用，如豬心蘋果酸脫氫酶，在25℃下保溫30分鐘，酶活為50％；加入70％甘油後，經同樣處理，活力為109％。
變性現象也可加以利用，如用酒精消毒，就是利用乙醇的變性作用來殺菌。在提純蛋白時，可用變性劑除去一些易變性的雜蛋白。工業上將大豆蛋白變性，使它成為纖維狀，就是人造肉。
五、蛋白質的顏色反應
蛋白質中的一些基團能與某些試劑反應，生成有色物質，可作為測定根據。常用反應如下：
1。雙縮脲反應
雙縮脲是有兩分子尿素縮合而成的化合物。將尿素加熱到180℃，則兩分子尿素縮合，放出一分子氨。雙縮脲在鹼性溶液中能與硫酸銅反應生成紅紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。蛋白質中的肽鍵與之類似，也能起雙縮脲反應，形成紅紫色絡合物。此反應可用於定性鑑定，也可在540nm比色，定量測定蛋白含量。
2。黃色反應
含有芳香族氨基酸特別是酪氨酸和色氨酸的蛋白質在溶液中遇到硝酸後，先產生白色沉澱，加熱則變黃，再加鹼顏色加深為橙黃色。這是因為苯環被硝化，產生硝基苯衍生物。面板、毛髮、指甲遇濃硝酸都會變黃。
3。米倫反應
米倫試劑是硝酸汞、亞硝酸汞硝酸和亞硝酸的混合物，蛋白質加入米倫試劑後即產生白色沉澱，加熱後變成紅色。酚類化合物有此反應，酪氨酸及含酪氨酸的化合物都有此反應。
4。乙醛酸反應
在蛋白溶液中加入乙醛酸，並沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間就會出現紫色環，凡含有吲哚基的化合物都有此反應。不含色氨酸的白明膠就無此反應。
5。坂口反應
精氨酸的胍基能與次氯酸鈉（或次溴酸鈉）及α萘酚在氫氧化鈉溶液中產生紅色物質。此反應可用來鑑定含精氨酸的蛋白質，也可定量測定精氨酸含量。
6。費林反應（Folin-酚）
酪氨酸的酚基能還原費林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸，生成藍色化合物。可用來定量測定蛋白含量。它是雙縮脲反應的發展，靈敏度高。
六、蛋白質的分離提純
（一）選材及預處理
1。 選材
主要原則是原料易得，蛋白含量高。蛋白質的主要來源包括動物、植物和微生物。由於種屬差異及培養條件和時間的差別，其蛋白含量可相差很大。植物細胞含纖維素，堅韌，不易破碎，且多含酚類物質，易氧化產生有色物質，難以除去。其液泡中常含有酸性代謝物，會改變溶液的pH。微生物因為容易培養而常用，但也需要破碎細胞壁。動物細胞易處理，但不經濟。
2。細胞破碎
如目的蛋白在細胞內，需要進行細胞破碎，使蛋白釋放出來。動物細胞可用勻漿器、組織搗碎機、超聲波、丙酮乾粉等方法破碎。植物可用石英砂研磨或纖維素酶處理。微生物的細胞壁是一個大分子，破碎較難。有超聲振盪、研磨、高壓、溶菌酶、細胞自溶等方法。
3。抽提
一般用緩衝液保持pH。可溶蛋白常用稀鹽提取，如0。1Mol/L NaCl。脂蛋白可用稀SDS或有機溶劑抽提，不溶蛋白用稀鹼處理。抽提的原則是少量多次。要注意防止植物細胞液泡中的代謝物改變pH，可加入鹼中和；為防止酚類氧化可加5mMol/L維生素C。加DFP或碘乙酸可抑制蛋白酶活力，防止蛋白被水解。
（二）粗提
主要目的是除去糖、脂類、核酸及大部分雜蛋白，並將蛋白濃縮。常用以下方法：
1。沉澱法
核酸沉澱劑：MnCl2、硫酸魚精蛋白、鏈黴素、核酸酶等
蛋白沉澱劑：醋酸鉛、單寧酸、SDS等，也可除多糖，沉澱後應迅速鹽析除去沉澱劑，以免目的蛋白變性。
選擇變性：用加熱、調節pH或變性劑選擇性地變性雜蛋白。如提取胰蛋白酶或細胞色素C時，因其穩定性高，可用2。5％三氯乙酸處理，使雜蛋白變性沉澱。
2。分級法
常用鹽析或有機溶劑分級沉澱蛋白。
3。除鹽和濃縮
鹽析後樣品中含大量鹽類，應透析除去。也可用分子篩，如Saphadex G25層析除鹽。如樣品過稀，可用反透析、凍幹、超濾等方法濃縮。
（三）精製
以上方法得到的製劑可供工業應用。如需高純樣品，應精製。常用方法有各種層析、電泳、等電聚焦、結晶等。蛋白結晶不等於無雜質，但變性蛋白不能結晶，所以可說明其具有生物活性。
本 章 考 點
本 章 名 詞 解 釋
氨基酸
（amino acid）：是含有一個鹼性氨基和一個酸性羧基的有機化合物，氨基一般連在α-碳上。
必需氨基酸
（essential amino acid）：指人（或其它脊椎動物）（賴氨酸，蘇氨酸等）自己不能合成，需要從食物中獲得的氨基酸。
非必需氨基酸
（nonessential amino acid）：指人（或其它脊椎動物）自己能由簡單的前體合成不需要從食物中獲得的氨基酸。
等電點
（pI，isoelectric point）：使分子處於兼性分子狀態，在電場中不遷移（分子的靜電荷為零）的pH值。
茚三酮反應
（ninhydrin reaction）：在加熱條件下，氨基酸或肽與茚三酮反應生成紫色（與脯氨酸反應生成黃色）化合物的反應。
肽鍵
（peptide bond）：一個氨基酸的羧基與另一個的氨基的氨基縮合，除去一分子水形成的醯氨鍵。
肽
（peptide）：兩個或兩個以上氨基透過肽鍵共價連線形成的聚合物。
蛋白質一級結構
（primary structure）：指蛋白質中共價連線的氨基酸殘基的排列順序。
層析
（chromatography）：按照在移動相和固定相 （可以是氣體或液體）之間的分配比例將混合成分分開的技術。
離子交換層析
（ion-exchange column）使用帶有固定的帶電基團的聚合樹脂或凝膠層析柱
透析
（dialysis）：透過小分子經過半透膜擴散到水（或緩衝液）的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術。
凝膠過濾層析
（gel filtrationchromatography）：也叫做分子排阻層析。一種利用帶孔凝膠珠作基質，按照分子大小分離蛋白質或其它分子混合物的層析技術。
親合層析（
affinity chromatograph）：利用共價連線有特異配體的層析介質，分離蛋白質混合物中能特異結合配體的目的蛋白質或其它分子的層析技術。
高壓液相層析
（HPLC）：使用顆粒極細的介質，在高壓下分離蛋白質或其他分子混合物的層析技術。
凝膠電泳
（gel electrophoresis）：以凝膠為介質，在電場作用下分離蛋白質或核酸的分離純化技術。
SDS-聚丙烯醯氨凝膠電泳
（SDS-PAGE）：在去汙劑十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯醯氨凝膠電泳。SDS-PAGE只是按照分子的大小，而不是根據分子所帶的電荷大小分離的。
等電聚膠電泳（IFE）：利用一種特殊的緩衝液（兩性電解質）在聚丙烯醯氨凝膠製造一個pH梯度，電泳時，每種蛋白質遷移到它的等電點（pI）處，即梯度足的某一pH時，就不再帶有淨的正或負電荷了。
雙向電泳
（two-dimensional electrophorese）：等電聚膠電泳和SDS-PAGE的組合，即先進行等電聚膠電泳（按照pI）分離，然後再進行SDS-PAGE（按照分子大小分離）。經染色得到的電泳圖是二維分佈的蛋白質圖。
Edman降解
（Edman degradation）：從多肽鏈遊離的N末端測定氨基酸殘基的序列的過程。N末端氨基酸殘基被苯異硫氰酸酯修飾，然後從多肽鏈上切下修飾的殘基，再經層析鑑定，餘下的多肽鏈（少了一個殘基）被回收再進行下一輪降解迴圈。
同源蛋白質
（homologous protein）：來自不同種類生物的序列和功能類似的蛋白質，例如血紅蛋白。
構形
（configuration）：有機分子中各個原子特有的固定的空間排列。這種排列不經過共價鍵的斷裂和重新形成是不會改變的。構形的改變往往使分子的光學活性發生變化。
構象
（conformation）：指一個分子中，不改變共價鍵結構，僅單鍵周圍的原子放置所產生的空間排布。一種構象改變為另一種構象時，不要求共價鍵的斷裂和重新形成。構象改變不會改變分子的光學活性。
肽單位
（peptide unit）：又稱為肽基（peptide group），是肽鍵主鏈上的重複結構。是由參於肽鏈形成的氮原子，碳原子和它們的4個取代成分：羰基氧原子，醯氨氫原子和兩個相鄰α-碳原子組成的一個平面單位。
蛋白質二級結構
（protein在蛋白質分子中的局布區域內氨基酸殘基的有規則的排列。常見的有二級結構有α-螺旋和β-摺疊。二級結構是透過骨架上的羰基和醯胺基團之間形成的氫鍵維持的。
蛋白質三級結構
（protein tertiary structure）： 蛋白質分子處於它的天然摺疊狀態的三維構象。三級結構是在二級結構的基礎上進一步盤繞，摺疊形成的。三級結構主要是靠氨基酸側鏈之間的疏水相互作用，氫鍵，範德華力和鹽鍵維持的。
蛋白質四級結構
（protein quaternary structure）：多亞基蛋白質的三維結構。實際上是具有三級結構多肽（亞基）以適當方式聚合所呈現的三維結構。
α-螺旋
（α-heliv）：蛋白質中常見的二級結構，肽鏈主鏈繞假想的中心軸盤繞成螺旋狀，一般都是右手螺旋結構，螺旋是靠鏈內氫鍵維持的。每個氨基酸殘基（第n個）的羰基與多肽鏈C端方向的第4個殘基（第4+n個）的醯胺氮形成氫鍵。在古典的右手α-螺旋結構中，螺距為0。54nm，每一圈含有3。6個氨基酸殘基，每個殘基沿著螺旋的長軸上升0。15nm。
β-摺疊
（β-sheet）： 蛋白質中常見的二級結構，是由伸展的多肽鏈組成的。摺疊片的構象是透過一個肽鍵的羰基氧和位於同一個肽鏈的另一個醯氨氫之間形成的氫鍵維持的。氫鍵幾乎都垂直伸展的肽鏈，這些肽鏈可以是平行排列（由N到C方向）或者是反平行排列（肽鏈反向排列）。
β-轉角
（β-turn）：也是多肽鏈中常見的二級結構，是連線蛋白質分子中的二級結構（α-螺旋和β-摺疊），使肽鏈走向改變的一種非重複多肽區，一般含有2～16個氨基酸殘基。含有5個以上的氨基酸殘基的轉角又常稱為環（loop）。常見的轉角含有4個氨基酸殘基有兩種型別：轉角I的特點是：第一個氨基酸殘基羰基氧與第四個殘基的醯氨氮之間形成氫鍵；轉角Ⅱ的第三個殘基往往是甘氨酸。這兩種轉角中的第二個殘侉大都是脯氨酸。
超二級結構
（super-secondary structure）：也稱為基元（motif）。在蛋白質中，特別是球蛋白中，經常可以看到由若干相鄰的二級結構單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規則的，在空間上能辨認的二級結構組合體。
結構域
（domain）：在蛋白質的三級結構內的獨立摺疊單元。結構域通常都是幾個超二級結構單元的組合。
纖維蛋白
（fibrous protein）：一類主要的不溶於水的蛋白質，通常都含有呈現相同二級結構的多肽鏈許多纖維蛋白結合緊密，併為 單個細胞或整個生物體提供機械強度，起著保護或結構上的作用。
球蛋白
（globular protein）：緊湊的，近似球形的，含有摺疊緊密的多肽鏈的一類蛋白質，許多都溶於水。典形的球蛋白含有能特異的識別其它化合物的凹陷或裂隙部位。
角蛋白
（keratin）：由處於α-螺旋或β-摺疊構象的平行的多肽鏈組成不溶於水的起著保護或結構作用蛋白質。
膠原（蛋白）
（collagen）：是動物結締組織最豐富的一種蛋白質，它是由原膠原蛋白分子組成。原膠原蛋白是一種具有右手超螺旋結構的蛋白。每個原膠原分子都是由3條特殊的左手螺旋（螺距0。95nm，每一圈含有3。3個殘基）的多肽鏈右手旋轉形成的。
疏水相互作用
（hydrophobic interaction）：非極性分子之間的一種弱的非共價的相互作用。這些非極性的分子在水相環境中具有避開水而相互聚集的傾向。
伴娘蛋白
（chaperone）：與一種新合成的多肽鏈形成複合物並協助它正確摺疊成具有生物功能構向的蛋白質。伴娘蛋白可以防止不正確摺疊中間體的形成和沒有組裝的蛋白亞基的不正確聚集，協助多肽鏈跨膜轉運以及大的多亞基蛋白質的組裝和解體。
二硫鍵
（disulfide bond）：透過兩個（半胱氨酸）巰基的氧化形成的共價鍵。二硫鍵在穩定某些蛋白的三維結構上起著重要的作用。
範德華力（van der Waals force）：中性原子之間透過瞬間靜電相互作用產生的一弱的分子之間的力。當兩個原子之間的距離為它們範德華力半徑之和時，範德華力最強。強的範德華力的排斥作用可防止原子相互靠近。
蛋白質變性
（denaturation）：生物大分子的天然構象遭到破壞導致其生物活性喪失的現象。蛋白質在受到光照，熱，有機溶濟以及一些變性濟的作用時，次級鍵受到破壞，導致天然構象的破壞，使蛋白質的生物活性喪失。
肌紅蛋白
（myoglobin）：是由一條肽鏈和一個血紅素輔基組成的結合蛋白，是肌肉內儲存氧的蛋白質，它的氧飽和曲線為雙曲線型。
復性
（renaturation）：在一定的條件下，變性的生物大分子恢復成具有生物活性的天然構象的現象。
波爾效應
（Bohr effect）：CO2濃度的增加降低細胞內的pH，引起紅細胞內血紅蛋白氧親和力下降的現象。
血紅蛋白
（hemoglobin）： 是由含有血紅素輔基的4個亞基組成的結合蛋白。血紅蛋白負責將氧由肺運輸到外周組織，它的氧飽和曲線為S型。
別構效應
（allosteric effect）：又稱為變構效應，是寡聚蛋白與配基結合改變蛋白質的構象，導致蛋白質生物活性喪失的現象。
鐮刀型細胞貧血病
（sickle-cell anemia）： 血紅蛋白分子遺傳缺陷造成的一種疾病，病人的大部分紅細胞呈鐮刀狀。其特點是病人的血紅蛋白β—亞基N端的第六個氨基酸殘缺是纈氨酸（vol），而不是下正常的穀氨酸殘基（Ghe）。
